連翹苷對L-谷氨酸誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞及APP/PS1小鼠的保護作用

胡馨予 孫曉琪 李志平

(1長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 130031；2吉林大學(xué)第一醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種慢性神經(jīng)退行性疾病〔1〕，主要發(fā)生在65歲以上的人群中，伴隨著年齡的升高，患病率也顯著提高〔2〕，目前，AD已成為中國患者的第五大死因，給患者及其家人帶來巨大的精神傷害和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。當(dāng)前應(yīng)用于AD的臨床治療藥物主要用于緩解癥狀，并且功效有限〔3〕，因此挖掘可用于AD治療的藥物刻不容緩。連翹苷從天然植物連翹的果實中提取而得〔4〕，有抗感染、抗氧化、抗病毒等功效〔5〕，本研究通過L-谷氨酸(L-Glu)誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷模型和APP/PS1小鼠模型從體外和體內(nèi)兩方面探討連翹苷的神經(jīng)保護作用，為連翹苷應(yīng)用于AD的臨床研究提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑 連翹苷(CAS號：487-41-2，分析標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%)、四甲基偶氮唑藍(MTT)購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素混合液購自索萊寶生物公司；胎牛血清購自四季青生物公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；凋亡試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒購自默克密理博公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自賽默飛世爾科技；二甲基亞砜(DMSO)、多聚甲醛購自阿拉丁公司；β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42抗體(ab201061)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2基因相關(guān)啟動子(Bad)抗體(ab32445)、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bid)抗體(ab62469)、Bcl-2抗體(ab182858)、大分子B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl-XL)抗體(ab32370)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體(ab32503)均購自Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，E-AB-20032)、兔二抗(E-AB-1001)購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.1.2細(xì)胞株 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系(HT22細(xì)胞)購自北納生物(BNCC)。

1.1.3實驗動物 8月齡SPF級APP/PS1小鼠36只；8月齡SPF級野生型(WT)小鼠12只，均購自南京生物醫(yī)藥研究院。

1.1.4儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；流式細(xì)胞儀購自默克密理博公司；小鼠水迷宮測試儀購自成都泰盟公司；熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司。

1.2方法

1.2.1HT22細(xì)胞培養(yǎng) 將HT22細(xì)胞均勻鋪在75 cm2貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達瓶底面積80%時進行傳代，細(xì)胞傳至第3代開始進行實驗。

1.2.2MTT比色法檢測細(xì)胞活力 將HT22細(xì)胞以5×103/孔的濃度鋪于96孔板內(nèi)。細(xì)胞分為7組，分別為空白組、模型組、5、10、20、40、80 μmol/L連翹苷組。24 h后，給藥組分別給予5、10、20、40、80 μmol/L連翹苷預(yù)處理3 h，模型組和給藥組細(xì)胞中加入L-Glu，使其終濃度為25 mmol/L，與細(xì)胞共同孵育24 h后，空白組、模型組和給藥組細(xì)胞中加入20 μl濃度為5 mg/ml MTT，37℃孵育4 h后，棄去孔板中的液體，每孔加入200 μl DMSO，37℃孵育15 min,用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處光密度值。

1.2.3細(xì)胞凋亡檢測 將HT22細(xì)胞以2×105/孔濃度鋪于6孔板內(nèi)。細(xì)胞分為4組，分別為空白組、模型組和5、20 μmol/L連翹苷組。24 h后分別給予5、20 μmol/L連翹苷預(yù)處理3 h，隨后加L-Glu和連翹苷共同孵育24 h，給藥結(jié)束后，棄去孔板內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入0.4 ml胰酶，放于37℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞，2 min后加入1 ml完全培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后與凋亡試劑反應(yīng)，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4線粒體膜電位檢測 將HT22細(xì)胞以2×105/孔濃度鋪于6孔板內(nèi)。細(xì)胞分為4組，分別為空白組、模型組和5、20 μmol/L連翹苷組。24 h后分別給予5、20 μmol/L連翹苷預(yù)處理3 h，隨后加L-Glu和連翹苷同時作用24 h，加入胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗滌2次后與染色劑反應(yīng)，通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位情況。

1.2.5APP/PS1小鼠給藥 將APP/PS1小鼠隨機分為3組，分別為模型組和5、20 mg/kg連翹苷組，用WT小鼠作為空白組，每組12只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始給藥，空白組和模型組口服生理鹽水(10 ml/kg)，連續(xù)給藥8 w。

1.2.6小鼠水迷宮測試 為評估小鼠的記憶能力，在給藥7 w后進行水迷宮實驗。在小鼠水迷宮裝置中加入自來水，水面沒過平臺1 cm，水中加入適量的二氧化鈦使水面渾濁。水溫維持21～24℃，將小鼠先放在平臺上適應(yīng)30 s，隨后將小鼠放入水中，小鼠找到平臺后，在平臺上停留30 s，若60 s內(nèi)無法找到，則引導(dǎo)小鼠找到平臺，停留30 s。訓(xùn)練4 d后進行測試，記錄小鼠找到平臺的時間和軌跡。

1.2.7小鼠解剖 小鼠給藥8 w后經(jīng)CO2吸入法進行安樂死處理，尾靜脈取血，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，3 000 r/min離心5 min，血清凍于-80℃?zhèn)溆?。取小鼠腦組織，一半腦固定在4%多聚甲醛中，室溫儲存，另一半凍于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8免疫組化檢測Aβ水平 腦組織在室溫固定24 h后，用乙醇梯度脫水，包埋后切成5 μm的薄片，脫蠟后在3%過氧化氫(H2O2)中孵育30 min，隨后置于10%的山羊血清中室溫封閉30 min，放在Aβ1～42抗體中4℃孵育12 h，PBS沖洗3次，每次8 min，再放入兔二抗中室溫孵育1 h，再次用PBS沖洗3次，每次8 min，室溫用染色劑染色15 min，脫水、封片后在熒光倒置顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。

1.2.9Western印跡 取小鼠海馬區(qū)組織10 mg左右，加入200 μl放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液充分勻漿，冰上裂解10 min后，12 000 r/min離心2次，每次5 min，取上清，通過BCA法對每組樣品進行蛋白定量。以40 μg/泳道的量加入蛋白樣品，用12%分離膠分離蛋白，隨后轉(zhuǎn)移至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，100 V，轉(zhuǎn)移60 min，用5%牛血清白蛋白(BSA)在4℃下封閉5 h后分別放于Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-XL和Bid抗體中，在4℃條件下孵育14 h，用洗滌緩沖液(TBST)洗滌孵育后的條帶，洗5次，每次8 min，隨后將條帶放入山羊抗兔二抗中，在4℃條件下孵育4 h，再用TBST洗5次，每次8 min，洗滌結(jié)束后用增強型電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑覆蓋在條帶表面，并置于顯影儀中拍照，用Image J1.8.0軟件對結(jié)果進行光密度分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用DSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1連翹苷對HT22細(xì)胞存活率的影響 與空白組細(xì)胞活力〔(100.00±6.26)%〕相比，模型組〔(55.74±4.51)%〕顯著降低(P<0.001)；與模型組比較，5、10、20、40、80 μmol/L連翹苷組〔(68.82±5.43)%、(75.58±1.20)%、(87.15±4.47)%、(89.61±3.79)%、(95.28±2.18)%〕均顯著升高，且20 μmol/L連翹苷組>10 μmol/L連翹苷組>5 μmol/L連翹苷組(P<0.01)；而20、40、80 μmol/L連翹苷組組間無顯著差異(P>0.05)。選取5、20 μmol/L連翹苷組進行后續(xù)實驗。

2.2連翹苷對HT22細(xì)胞凋亡的影響 與空白組細(xì)胞凋亡率〔(10.62±0.66)%〕相比，模型組〔(16.36±1.86)%〕顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，5、20 μmol/L連翹苷組〔(11.29±0.80)%、(8.41±1.08)%〕均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 連翹苷對HT22細(xì)胞凋亡的影響

2.3連翹苷對HT22細(xì)胞線粒體膜電位的影響 與空白組線粒體膜電位〔去極化(6.30±0.50)%〕相比，模型組〔去極化(14.88±0.28)%〕顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，5、20 μmol/L連翹苷組〔去極化(13.00±0.38)%、(8.82±0.35)%〕均顯著降低(P<0.05)。見圖2。

2.4連翹苷對APP/PS1小鼠行為學(xué)的影響 與空白組小鼠尋找平臺的時間〔(19.92±7.85)s〕相比，模型組〔(52.64±7.95)s〕顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，5、20 mg/kg連翹苷組〔(41.90±10.11)s、(30.48±14.80)s〕均顯著降低(P<0.01)。見圖3。

2.5連翹苷對APP/PS1小鼠腦中Aβ的影響 與空白組小鼠大腦中Aβ斑塊面積(1.00±0.10)相比，模型組(5.33±0.61)顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，5、20 mg/kg連翹苷組〔(3.67±0.99)、(2.47±0.45)〕均顯著降低(P<0.01)。見圖4。

圖2 連翹苷對HT22細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖3 連翹苷對APP/PS1小鼠水迷宮的影響

圖4 連翹苷對APP/PS1小鼠腦中Aβ斑塊的影響(DAB染色,×40)

2.6連翹苷對APP/PS1小鼠腦中凋亡相關(guān)蛋白的影響 與空白組相比，模型組Bad、Bax、Bid水平均顯著升高，Bcl-2、Bcl-XL水平均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，5、20 mg/kg連翹苷組Bad、Bax、Bid水平均顯著降低，Bcl-2、Bcl-XL水平均顯著升高(P<0.05)。見表1、圖5。

表1 連翹苷對APP/PS1小鼠腦中Bcl-2家族蛋白的影響

1～4：空白組、模型組、5 mg/kg連翹苷組、20 mg/kg連翹苷組圖5 連翹苷對APP/PS1小鼠腦中Bcl-2家族蛋白的影響

3 討 論

AD已成為老年人發(fā)病率最高的疾病之一〔6〕。AD的發(fā)病過程中會發(fā)生神經(jīng)元的大量凋亡〔7〕。AD常伴隨著線粒體功能障礙的發(fā)生〔8〕。線粒體膜電位的失衡與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，進而會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔9，10〕。AD患者的空間認(rèn)知能力和記憶力較差〔11，12〕。水迷宮是檢測實驗動物對空間的識別和記憶能力的經(jīng)典實驗〔9，13〕。大腦中Aβ斑塊沉積是AD的顯著病理特征〔14〕。Bcl-2家族蛋白能直接反映線粒體凋亡的水平，是線粒體功能障礙的顯著標(biāo)志物〔15，16〕，Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種〔17〕，Bad、Bax和Bid蛋白含量增加會促進細(xì)胞凋亡，相反，Bcl-2和Bcl-XL蛋白含量增加會抑制細(xì)胞凋亡，通常用Bcl-2/Bax來判斷細(xì)胞的凋亡情況〔18〕。本研究結(jié)果說明連翹苷能通過抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡起到保護神經(jīng)的作用。