USP9X與MCL-1在鼻咽癌中表達(dá)及預(yù)后分析

馮燚源 楊晶 張雪 李珊珊 李源泉 楊洪斌

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

Expression and prognosis of USP9X and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma

FENG Yi-Yuan,YANG Jing,ZHANG Xue,etal.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of USP9X and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma and their correlation with the prognosis of nasopharyngeal carcinoma.Methods100 patients with nasopharyngeal carcinoma were selected,their cancerous tissues were extracted as the observation group,and then 100 normal nasopharynx tissues were extracted as the control group.The expression of USP9X and MCL-1 in the two groups were detected by immunohistochemistry Envision method.The expression of USP9X and MCL-1 were observed in nasopharyngeal carcinoma patients with different tumor stages,infiltration depth and lymph node metastasis.USP9X and MCL-1 positive nasopharyngeal carcinoma patients were treated with radiotherapy and chemotherapy,and their cancer cells were extracted for cell culture.Western blot was used for protein quantitative analysis to observe the expression of Usp9x and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma patients with positive USP9X and MCL-1 before and after radiotherapy and chemotherapy.ResultsThere were 72 USP9X-positive patients in the observation group and only 2 in the control group.The data of the two groups were statistically significant (χ2=6.937,P=0.001).There were 75 MCL-1 positive patients in the observation group.There was only one person in the control group,and the data between the two groups was statistically significant (χ2=7.634,P=0.001);the levels of USP9X and MCL-1 were related to tumor stage,depth of invasion and lymph node metastasis,and the more serious the disease was,the more obvious the expression of USP9X and MCL-1 were(P<0.05);After radiotherapy and chemotherapy,the expression of USP9X and MCL-1 in nasopharyngeal carcinoma patients were significantly decreased (P<0.05),and Western blot also showed that the protein expression were significantly decreased (P<0.05).ConclusionsUSP9X and MCL-1 are highly expressed in nasopharyngeal carcinoma patients,and their expression are significantly decreased after radiotherapy and chemotherapy,which could be used as one of the diagnostic criteria for the prognosis of nasopharyngeal carcinoma.

【Keywords】 USP9X;MCL-1;Nasopharyngeal carcinoma

鼻咽癌是我國南方地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，病死率較高且呈逐年上升趨勢〔1〕，早期鼻咽癌患者以放療為主，晚期以放化療相結(jié)合的方式為主〔2〕，有研究〔3〕表明鼻咽癌治療結(jié)果不僅與腫瘤分期、蔓延程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，還與患者的自身情況有關(guān)，因此探尋腫瘤的發(fā)病機(jī)制，對鼻咽癌的診斷及治療預(yù)后等方面具有重要意義。本文探討X染色體連鎖的泛素特異肽酶9(USP9X)與髓細(xì)胞白血病基因(MCL)-1在鼻咽癌中表達(dá)及其與鼻咽癌預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月至2019年1月在河北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診為鼻咽癌的患者100例，納入標(biāo)準(zhǔn)〔4,5〕：①所有患者經(jīng)病理證實(shí)為鼻咽癌；②所有患者在檢查前2 w內(nèi)未有感冒、發(fā)燒等急性感染。排除標(biāo)準(zhǔn)〔6,7〕：①嚴(yán)重心臟、肝臟等重要臟器衰竭者；②嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙，不能配合檢查者；③乙肝等傳染性疾病者。其中男54例，女46例，平均年齡(56.85±16.23)歲，所有患者臨床資料完整；再選取健康體檢人群100例，其中男48例，女52例，平均年齡(58.62±15.69)歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已取得入組對象同意及倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法 提取鼻咽癌患者癌變組織作為觀察組，提取100名健康體檢人群的鼻咽組織作為對照組，采用免疫組化Envision法檢測兩組USP9X與MCL-1的表達(dá)情況，探討觀察組中不同的腫瘤分期、蔓延程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下，USP9X與MCL-1的表達(dá)情況。對觀察組USP9X與MCL-1陽性的鼻咽癌患者進(jìn)行放化療，提取USP9X與MCL-1陽性鼻咽癌患者的癌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，采用Western印跡法進(jìn)行蛋白定量分析相比得出各目的蛋白的相對灰度值，觀察USP9X與MCL-1陽性的鼻咽癌患者放化療前后USP9X與MCL-1的表達(dá)情況。

免疫組化Envision法：將蠟塊切成適宜厚度的組織切片進(jìn)行脫蠟，將脫蠟后的切片過1遍蒸餾水，放入過氧化氫溶液中浸泡，避光處理〔8〕，流水沖洗，再過蒸餾水，采用檸檬酸鹽和EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)，置于4℃環(huán)境過夜孵育一抗〔9〕，復(fù)溫后孵育二抗，在切片上滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液，將切片置于蘇木素中復(fù)染，最后將切片脫水晾干后封片〔10〕。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：USP9X及MCL-1均定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒者判讀為陽性細(xì)胞〔11〕。每張切片隨機(jī)選擇 5 個具有代表性的視野，在高倍鏡(×400)下進(jìn)行觀察。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例判定是否為陽性〔12〕。染色強(qiáng)度〔13〕：無色計(jì) 0 分，淺黃色計(jì) 1 分，棕黃色計(jì) 2 分，棕褐色計(jì) 3 分；陽性細(xì)胞百分比〔14〕：≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；總分為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積〔15〕：≤4分為陰性，>4分為陽性表達(dá)。

Western印跡：首先依據(jù)USP9X及MCL-1蛋白分子量的大小選擇最佳分離膠的濃度來配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)〔16〕，凝膠緩緩加入雙層玻璃板夾層內(nèi)，完全變干再加入濃縮膠將雙層玻璃板填滿，待濃縮膠完全凝固后，將玻璃板放入電泳槽中靜置10 min左右，觀察玻璃板有無漏液，確定無漏液后開始上樣〔17〕，上樣結(jié)束后接通電泳儀電源，調(diào)節(jié)電源電壓至90 V，當(dāng)溴酚藍(lán)與樣品接近分離膠的底部時結(jié)束電泳，電泳時長120 min左右〔18〕，選取恰當(dāng)?shù)木燮蚁?PVDF)膜，浸泡于甲醇中15 s，激活后放入轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，調(diào)節(jié)電流為200 mA，具體轉(zhuǎn)膜時間依據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量大小而定〔12〕。 使用5%脫脂奶粉配制的封閉液進(jìn)行封閉，再將5%脫脂奶粉稀釋至適宜濃度進(jìn)行孵育一抗〔19〕，將配制好的液體置于搖床上，4℃恒溫過夜，第二天取出配制好的液體，使用PBS進(jìn)行洗滌后進(jìn)行孵育二抗，放置在 37℃孵箱中孵育 70 min左右，使用BCA法〔20〕測定蛋白濃度，再使用 Image lab軟件分析顯影條帶的相對灰度，將USP9X、MCL-1蛋白的相對灰度與內(nèi)參(α-Tubulin)相比得出各目的蛋白的相對灰度值〔21〕。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，Pearson 線性相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

觀察組與對照組USP9X陽性(72例 vs 2例)MCL-1陽性(75例 vs 1例)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.937、7.634，均P=0.001)。

腫瘤分期Ⅲ+Ⅳ期USP9X與MCL-1陽性檢出率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)，腫瘤蔓延程度T3+T4期陽性檢出率明顯高于T1+T2期(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者陽性檢出率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)。見表1。

USP9X陽性放化療后僅剩31例，放化療前后相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.732，P=0.034)；MCL-1陽性放化療后僅33例，放化療前后相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.039，P=0.029)。

放化療前USP9X平均相對灰度值為2.983±0.307，放化療后為1.572±0.278，放化療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.732，P=0.001)；放化療前MCL-1平均相對灰度值為1.798±0.203，放化療后為0.579±0.135，放化療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.987，P=0.001)。

表1 USP9X、MCL-1在不同的腫瘤分期、蔓延程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下陽性檢出率對比〔n(%)〕

3 討 論

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，近年來鼻咽癌的發(fā)病率呈上升趨勢，病死率較高，但若能在鼻咽癌早期進(jìn)行干預(yù)治療，患者生存率將大幅度提高，因此盡早確診鼻咽癌對患者預(yù)后至關(guān)重要，目前臨床上常用來診斷鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)之一為檢測到人類皰疹(EB)病毒〔22〕，但臨床數(shù)據(jù)顯示EB病毒第四型診斷鼻咽癌的特異性并不高，如淋巴瘤及病毒性感冒的患者中EB病毒檢測也呈陽性，且EB病毒的檢測較繁瑣，需要檢測與其相關(guān)的4種抗原〔23〕。本研究結(jié)果表明，可以初步將USP9X與MCL-1作為臨床診斷鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)之一。 USP9X的本質(zhì)是一種特異性的去泛素化酶，有研究〔24〕表明USP9X大部分定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜交界的凹陷處，也可存在于特定的細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，可參與細(xì)胞凋亡的過程，USP9X可與ASK1相互作用，從而抑制細(xì)胞凋亡〔25〕。本研究結(jié)果表明腫瘤的惡性程度越高，USP9X的陽性檢出率越高，而患者的預(yù)后往往與病理分期有關(guān)，因此可以初步推斷USP9X可以用于評估鼻咽癌患者的預(yù)后。本研究結(jié)果證實(shí)了USP9X可以用于評估鼻咽癌患者的預(yù)后，且有研究〔26〕表明，USP9X的低表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤對化療藥物的敏感性。 MCL-1本質(zhì)上是一種抗凋亡蛋白，對維持細(xì)胞的存活、分化具有重要意義。有研究〔27〕表明，MCL-1的過表達(dá)與患者的不良預(yù)后有關(guān)，這一結(jié)論也與本研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果同樣說明MCL-1的陽性檢出率與患者預(yù)后密切相關(guān)。MCL-1可以用于評估鼻咽癌患者的預(yù)后。有研究表明USP9X與MCL-1之間呈正相關(guān)，隨著USP9X陽性檢出率的下降，MCL-1的陽性檢出率也隨之下降，分析原因認(rèn)為，MCL-1 是 USP9X 的特異性底物之一，USP9X 能通過去泛素化作用保護(hù)MCL-1免于被降解，從而穩(wěn)定MCL-1，保證了腫瘤的生存條件〔28〕。

綜上，鼻咽癌的早診斷早治療對患者生存率具有至關(guān)重要的作用，USP9X與MCL-1在鼻咽癌中呈高表達(dá)，且在放化療后表達(dá)顯著降低，可作為臨床診斷及評價鼻咽癌患者預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)之一。