導(dǎo)流雜交法檢測性傳播疾病病原體核酸的臨床應(yīng)用價值分析

秦澤鴻，方炳雄*，陳漢強，方金萍，劉琪，蔡潔娜，張俊賢，翁文婕（普寧市人民醫(yī)院：.檢驗科；.皮膚科；.藥學(xué)部，廣東 普寧 5500）

性疾病是長期以來危害人類健康的臨床常見病，且部分性疾病具有高度傳染性，致病微生物主要通過性接觸感染，不僅嚴(yán)重?fù)p害患者健康并且給他人健康埋下安全隱患［1］。早期、快速、準(zhǔn)確的檢測與診斷對早期針對性的干預(yù)具有重要的意義，已被臨床廣泛重視，但現(xiàn)階段，不同病原體的檢測方法不同，流程較為繁瑣，時間較長，性傳播疾病(STD)病原體的檢測方法有待進一步提高［2］。基因芯片導(dǎo)流雜交技術(shù)集多重PCR檢測法、雜交法、基因芯片法于一身，實現(xiàn)一次取材多種病原體檢測［3］，本研究采用導(dǎo)流雜交技術(shù)對2018年1月至2019年6月我院皮膚性病科收診的1 077例疑似生殖道感染的男性患者進行檢測，觀察各類病原體的感染率，以為后期導(dǎo)流雜交法臨床應(yīng)用及更好的指導(dǎo)臨床治療提供參考。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年6月我院收診的疑似生殖道感染的男性患者1 077例，年齡22～68（46.68±9.52）歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）取得患者知情同意；（2）臨床資料完整；（3）初診；（4）精神狀態(tài)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）對研究存在異議；（2）惡病質(zhì)；（3）嚴(yán)重慢性及基礎(chǔ)疾??；（4）合并其他類型傳染??；（5）中途退出或轉(zhuǎn)院者。

1.3 方法

1.3.1 所有患者完善臨床信息后均接受導(dǎo)流雜交法檢測 囑患者樣本采集前2 h不能排尿，采用細(xì)小棉拭子伸入尿道2～4 cm并捻動收集患者尿道分泌物，2℃～8℃暫存送檢。采用生殖道感染病原體核算檢測試劑盒（PCR+導(dǎo)流雜交法）進行檢測：（1）DNA提取：1.0 ml生理鹽水漂洗拭子20 s，13 000 r/min離心5 min，棄上清，煮沸法提取DNA，-20℃?zhèn)溆?。?）PCR擴增：按照試劑盒操作說明，解凍后8 000 r/min離心5 min，配置反應(yīng)體系50μl，擴增程序：先預(yù)變性：95℃，9 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃40 s共40 cycle；最后72℃5 min，16℃維持完成擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)過熱變性，成為單鏈DNA，用于與探針雜交。（3）導(dǎo)流雜交法：按照試劑盒說明書完成實驗前準(zhǔn)備和雜交前準(zhǔn)備，完成后采用PCR產(chǎn)物50μl 95℃加熱2 min，雜交孔內(nèi)添加1 ml雜交液（45℃），溫育至少2 min，棄雜交液，在PCR產(chǎn)物中加入0.5μl雜交液（45℃）混勻，加在薄膜中溫育10 min開泵進行導(dǎo)流雜交，采用洗脫液（45℃）洗膜3次，每次0.8 ml，完成后關(guān)泵。完成后將雜交儀溫度設(shè)定為25℃，0.5 ml封阻液封閉膜，排出后再加0.5 ml封阻液封閉5 min，排除封阻液，加0.5酶標(biāo)液溫育5 min，完成后將所有溶液排除，溫度調(diào)整至36℃，配套溶液A液洗膜4次，0.8 ml/次，完成后加0.5 ml顯色液，顯色5 min，排除顯色液另加雜交液洗膜3次，0.8 ml/次，完成后加2 ml蒸餾水漂洗，1 h內(nèi)分析結(jié)果。陽性結(jié)果判定：陰性對照點無信號，病原體感染陽性點為藍(lán)紫色圓點；病原體感染種類參照試劑盒說明中病原體對應(yīng)位點。

1.3.2 解脲支原體和人型支原體的培養(yǎng)+藥敏采用支原體鑒定、藥敏試劑盒（微生物檢驗法）完成檢測，相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑說明進行，UU利用尿素產(chǎn)堿，Mh利用精氨酸產(chǎn)堿的特性，能使得培養(yǎng)基中酚紅發(fā)生由黃變紅的顏色變化，判讀是否有支原體感染［4］。選用臨床常用于UU、Mh支原體治療有效的12種抗生素，包括四環(huán)素(TET)、氧氟沙星(OFL)、紅霉素(ERY)、強力霉素(DOX)、交沙霉素(JOS)、司帕沙星(SPA)、羅紅霉素(ROX)、美滿霉素(MIN)、左旋氧氟沙星(LEV)、克拉霉素(CLA)、阿奇霉素(AZL)、諾氟沙星(NOR)。選用高低兩個濃度進行藥敏試驗，操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明進行，陽性判讀：陽性為紅色，陰性為黃色，敏感（S）：高低濃度均為黃色；中敏（I）：低濃度為紅色，高濃度為黃色；耐藥（R）：高低濃度均為紅色［5］。

1.4 臨床觀察指標(biāo) （1）觀察病原體的感染情況；（2）觀察HPV與解脲支原體（UU）各亞型陽性檢出率；（3）比較導(dǎo)流雜交法與培養(yǎng)法檢測UU和人型支原體(Mh)陽性檢出率；（4）觀察UU、Mh的藥敏培養(yǎng)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。計量資料采用±s表示，行t檢驗；計數(shù)資料采用例（百分率）表示，行χ2檢驗。P<0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 導(dǎo)流雜交法檢測病原體的感染情況 結(jié)果顯示，1077例中陽性606例，感染率為56.27%（606/1 077）；單一病原體感染：447例；兩種病原體感染：132例；三種病原體感染：24例；四種病原體感染：3例。其中HPV：402例；NG：104例；CT：67例；UU：148例；Mh：39例；Mg：15例；HSV II：20例。見圖1。

圖1 606例陽性患者病原體感染種類及分布示意圖

2.2 導(dǎo)流雜交法檢測HPV及UU分型結(jié)果分析 結(jié)果顯示，HPV陽性402例，感染率為37.33%（402/1 077），檢出率前六位的HPV亞型分別為6亞型（16.16%）、11亞型（9.66%）、16亞型（4.83%）、52亞型（4.64%）、18亞型（2.97%）和51亞型（2.97%），見表1和圖2。UU陽性148例，感染率為13.74%(148/1 077)，其中Uuu：68例（6.31%）；Uup1:13例（1.21%）；Uup3:57例（5.29%）；Uup6：8例（0.74%）；Uup14:2例（0.19%）。

圖2 1 077例男性HPV各亞型陽性檢出率分布

表1 1 077例男性HPV各亞型陽性檢出率

2.3 導(dǎo)流雜交法與培養(yǎng)法檢測UU、Mh陽性結(jié)果分析 結(jié)果顯示，導(dǎo)流雜交法與培養(yǎng)法檢測UU陽性例數(shù)分別為148例和132例(13.74%VS 12.26%，χ2=1.051，P=0.305)；Mh陽性例數(shù)分別為39例和27例(3.62%VS 2.51%，χ2=2.251，P=0.134)。導(dǎo)流雜交法檢測UU的靈敏度、特異性和符合度分別為99.24%、98.20%和98.33%，檢測Mh的靈敏度、特異性和符合度分別為92.59%、98.67%和98.51%。見表2。

表2 導(dǎo)流雜交法檢測UU、Mh的應(yīng)用價值

2.4 不同UU、Mh表達(dá)患者藥敏培養(yǎng)結(jié)果分析 培養(yǎng)法檢測UU、Mh陽性分別為132例和27例，兩者同時陽性22例，藥敏結(jié)果顯示，UU、Mh均陽性者耐藥前五位分別為NOR、AZL、TET、JOS、LEV，耐藥率分別為77.27%（17/22）、68.18%（15/22）、63.64%（14/22）、54.55%（12/22）、50.00%（11/22），以ERY、DOX、ROX最為敏感，依次為ROX>DOX>ERY，但DOX無耐藥病例。UU陽性而Mh陰性者耐藥前五位分別為NOR、OFL、AZL、TET、SPA，耐藥率分別為60.00%（66/110）、49.09%（54/110）、45.45%（50/110）、40.91%（45/110）、36.36%（40/110），以DOX最為敏感。UU陰性而Mh陽性者以TET、OFL、AZL耐藥性最高，耐藥率均為80%，JOS、MIN、NOR次之，耐藥率均為60%，以DOX最為敏感。見表3。

表3 137例支原體陽性藥敏結(jié)果

3 討論

現(xiàn)階段，隨著國民思想不斷開放，人們對性的關(guān)注度不斷提升，但由于STD病原體較多，且相關(guān)疾病認(rèn)知、預(yù)防等知識普及度相對低下，導(dǎo)致近年來我國STD感染情況日趨嚴(yán)重，不僅影響患者及他人身體和心理健康，甚至影響下一代的健康［6］。在積極推廣STD相關(guān)疾病健康知識教育的同時，快速、有效的檢測和早期針對性的抗生素治療是改善患者預(yù)后狀態(tài)的關(guān)鍵［7］。目前，不同STD病原體以及不同性別患者檢測方法有所差異，在考慮合并多種病原體感染時，往往需要重復(fù)多次取材進行分別檢測，不僅增加了工作量，并且增加了患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［8］，故STD病原體檢測方法仍有待提高。

此外，本研究采用培養(yǎng)法對導(dǎo)流雜交法檢測的UU及Mh陽性病例進行分析，結(jié)果顯示，導(dǎo)流雜交法與培養(yǎng)法檢測UU陽性例數(shù)分別為148例和132例(13.74%VS 12.26%，χ2=1.051，P=0.305)；Mh陽性例數(shù)分別為39例和27例(3.62%VS 2.51%，χ2=2.251，P=0.134)。導(dǎo)流雜交法檢測UU的靈敏度、特異性和符合度分別為99.24%、98.20%和98.33%，檢測Mh的靈敏度、特異性和符合度分別為92.59%、98.67%和98.51%。提示導(dǎo)流雜交法與培養(yǎng)法具有相當(dāng)?shù)臋z測效能，且較培養(yǎng)法更加快速、便捷。本研究培養(yǎng)法檢測UU、Mh陽性者分別為132例和27例，兩者同時陽性22例，藥敏結(jié)果顯示，UU、Mh均陽性者以耐諾氟沙星、阿奇霉素、四環(huán)素、交沙霉素、左旋氧氟沙星最為常見，以紅霉素、強力霉素、羅紅霉素治療最為敏感，且強力霉素?zé)o耐藥病例。UU陽性而Mh陰性者以耐諾氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、四環(huán)素、司帕沙星最為常見，以強力霉素治療最為敏感。UU陰性而Mh陽性者以耐四環(huán)素、氧氟沙星、阿奇霉素最常見，以強力霉素治療最為敏感。

綜上所述，導(dǎo)流雜交法在STD病原體檢測和分型中作用明顯，能夠準(zhǔn)確的檢測STD病原體類型及各亞型，采用藥敏試驗指導(dǎo)臨床用藥具有重要的意義。