基于敞開式直接電離質(zhì)譜技術的尿液中毒品檢測

熊士領, 洪歡歡,2, 聞路紅,2, 胡舜迪,2, 陳安琪,2, 熊 偉,2, 陳 臘,2*

(1. 寧波大學高等技術研究院, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司, 浙江 寧波 315100)

《2020年中國毒情形勢報告》相關數(shù)據(jù)顯示,目前國內(nèi)毒品濫用人數(shù)增速減緩但吸毒群體規(guī)模依然較大。吸毒人員篩查技術是毒品監(jiān)管和禁毒工作的重要支撐,為管控吸毒人員提供科學依據(jù)。自2011年《吸毒成癮認定辦法》實施以來,尿液中的毒品檢測是常用的吸毒人員現(xiàn)場快速篩查手段之一,其檢測結果也被認為是吸毒成癮認定的標準。相比于體外毒品,尿液中的毒品具有成分復雜、含量低、機體新陳代謝干擾大等特點[1],對高效的現(xiàn)場毒品分析技術提出了挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的免疫膠體金分析法存在假陽性和假陰性比例高、單次可檢測物質(zhì)種類少等缺點[2];光譜法技術在檢測混合物樣品時,存在定量能力不足等問題[3]。實驗室質(zhì)譜技術是目前常見生物樣本中毒品物質(zhì)分析與檢測手段的金標準方法,然而其對于單個樣品檢測前處理過程相對復雜[4],使用環(huán)境要求相對苛刻,耗時較長,不滿足一線的毒品現(xiàn)場快速檢測需求。

近年來,直接電離質(zhì)譜技術突飛猛進,如實時直接分析(DART)[5]、解吸電噴霧離子源(DESI)[6]、介質(zhì)阻擋放電(DBDI)[7,8]等,不需要樣品前處理或僅需簡單的樣品前處理即可實現(xiàn)樣品原位分析,而且分析效率高,靈敏度高,已成功應用于公共安全、食品安全、環(huán)境檢測等領域[9,10]。上述直接電離技術因需載氣工作,導致進樣裝置相對復雜,從而限制了其在現(xiàn)場、便攜式方向的應用。脈沖式電噴霧離子化技術[11],具有樣品需求量少、體積小、重量輕、無須載氣等特點,已成功應用于實際樣品中磺胺類物質(zhì)的篩查和分析[12];寧波華儀寧創(chuàng)智能科技公司在脈沖式電噴霧離子化技術的基礎上研制了探針式電噴霧離子源,并已成功應用于毛發(fā)、污水等毒品檢測儀器中。

本工作基于探針式電噴霧離子源與便攜式質(zhì)譜儀聯(lián)用快檢平臺,建立面向生物樣本的敞開式直接電離質(zhì)譜技術的檢測方法,旨在滿足一線毒品檢測的檢測速度快、樣品種類多、準確率高以及檢出限低等需求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CRAIV-110便攜式質(zhì)譜儀、探針式離子源(寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司),探針噴頭(武漢微探生物科技有限公司); Vortex-5渦旋儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

純凈水(娃哈哈,杭州娃哈哈集團有限公司);乙腈和乙酸乙酯(色譜純,美國TEDIA);磷酸氫二鈉、氫氧化鈉(國藥試劑);甲基苯丙胺(methamphetamine)、氯胺酮(ketamine)、可卡因(cocaine)、O6-單乙酰嗎啡(6-monoacetylmorphine)和3,4-亞甲雙氧甲基苯丙胺(MDMA)5種標準品溶液(質(zhì)量濃度100 μg/mL,公安部門)。

空白尿液樣本的采集對象為云南省某市的5名健康男性,年齡區(qū)間在20～35歲。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品制備

使用乙腈溶液分別對100 μg/mL的5種毒品標準液進行稀釋,獲得50 ng/mL的5種單標溶液。

分別取空白尿液300 μL,隨后加入精確量取的nμL 100 μg/mL5種毒品標準液至1.5 mL離心管中,加入(1000-n) μL乙腈,渦旋1 min后配制1、4、8、10、20、40、50、100、200、300、1 000 ng/mL等5種毒品的稀釋溶液,待測。

將50 mL 0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液與26.9 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液混合均勻,加純水稀釋至100 mL,配制成pH 12的緩沖鹽溶液。

1.2.2樣品前處理

取300 μL待測尿液樣品,加入300 μL pH 12的緩沖鹽溶液,靜置1 min,加入300 μL乙酸乙酯直接萃取,靜置1 min,之后渦旋30 s,離心1 min,最后用探針蘸取上層有機相約1 μL待測。

1.3 儀器條件

便攜式質(zhì)譜儀見圖1-Ⅰ。采樣毛細管:內(nèi)徑為0.37 mm,長度為100 mm,直流電壓為90 V;線性離子阱:共振激發(fā)所用交流電的電壓為1～4 V,射頻(radio frequency, RF)幅值電壓為120～1 500 V, RF頻率為1.08 MHz;打拿極電壓:-5 500 V;倍增器電壓:-1 100 V;選擇標準模式進行質(zhì)量掃描,掃描范圍為m/z50～700,儀器分辨率為1 Da;前級真空壓力:0.69 kPa。

圖 1 探針式電噴霧離子源-便攜式質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)Fig. 1 Setup of the probe type electrospray ion source and portable mass spectrometer system

探針式離子源見圖1-Ⅲ。離子源極性:正離子模式(ESI+);探針噴頭為石英玻璃毛細管:外徑為1.5 mm,內(nèi)徑為1.1 mm,長度為5 cm;噴頭針尖口徑:50 μm;噴頭針尖到質(zhì)譜儀入口距離:10 mm。

MS2分析質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 各毒品的MS2分析參數(shù)Table 1 MS2 analysis parameters for each drug

2 結果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1噴霧電壓

為了使探針式電噴霧離子源-便攜式質(zhì)譜儀達到最佳的檢測狀態(tài),有必要提高離子化效率和提升離子的傳輸效率,因此需對探針式離子源的噴霧電壓和便攜式質(zhì)譜儀的毛細管溫度進行優(yōu)化。由于敞開式離子源信號難免受到各種因素干擾,導致質(zhì)譜信號波動,因此本工作采用計算平均峰強的方法來減小信號波動所帶來的誤差,離子強度信號的波動可用相對標準偏差(RSD)來表征。

使用50 ng/mL的可卡因乙腈溶液作為測試樣品,待檢測前用等體積乙酸乙酯進行萃取,蘸取上層有機相直接分析,并以二級質(zhì)譜分析模式下可卡因的子離子(m/z182)強度作為考察指標,其中每個數(shù)據(jù)點采樣5次,且每次更換不同探針。該強度取值方式為:在整個采樣時間內(nèi),當5 s后某一時刻的離子強度下降到最初5 s時間內(nèi)離子強度平均值的1/2時,則將該段時間內(nèi)的離子強度的平均值作為有效強度。在0.3～4.8 kV噴霧電壓范圍內(nèi),考察了探針式電噴霧離子源的噴霧電壓對離子信號強度和噴霧時間的影響。由圖2a可以看出,隨著噴霧電壓從0.3 kV升高至1.3 kV,信號強度從零開始陡升,這是因為施加的噴霧電壓在1.3 kV時,達到液體表面產(chǎn)生電荷分離所需的電場的閾值電壓[13]。在1.3～3.3 kV時隨著噴霧電壓的增加,信號強度出現(xiàn)小幅度的先下降后上升,這是因為隨著電壓的不斷增大噴霧頻率開始加大,產(chǎn)生的噴霧液滴出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)[14];在電壓超過3.3 kV之后,噴霧頻率增加且噴霧液滴變大,去溶劑化效果變差[15,16],從而導致離子在質(zhì)譜儀內(nèi)傳輸時損失增加。相比在1.3～3.3 kV噴霧電壓下的各信號響應強度,噴霧電壓為1.8 kV時,信號強度波動較小。

圖 2 (a)相對離子強度和(b)相對噴霧時間與噴霧電壓關系,(c)噴霧電壓為1.8 kV時離子強度隨時間變化曲線, (d)相對離子強度與傳輸毛細管溫度的關系(n=5)Fig. 2 (a) Relative ion intensities and (b) relative spray time versus spray voltage, (c) ion intensity over time at a spray voltage of 1.8 kV, and (d) relationship between relative ion intensities and transport capillary temperatures (n=5)

如圖2b所示,隨著噴霧電壓的不斷增大,產(chǎn)生噴霧的持續(xù)時間(計算離子有效強度時其對應的時長)與其呈負相關,因為在探針內(nèi)溶液量一定的情況下,噴霧電壓越大噴霧的速度就越快,噴霧持續(xù)時間就越短。當噴霧電壓在1.3 kV以下時,無法產(chǎn)生噴霧,因此圖2b不包含該范圍內(nèi)數(shù)據(jù)。

當噴霧電壓設為1.8 kV時,離子峰強度隨時間變化曲線如圖2c所示,可以看到離子峰強度在前45 s內(nèi)相對比較穩(wěn)定,RSD<10%,隨后信號強度逐漸下降?？紤]到信號穩(wěn)定性和噴霧時長對數(shù)據(jù)分析的影響,除特殊說明外,本工作后續(xù)所有實驗的噴霧電壓均設置為1.8 kV,所有離子峰強度檢測均采用噴霧前20 s內(nèi)的有效強度數(shù)據(jù)計算平均值。

2.1.2進樣口溫度

由于便攜式質(zhì)譜儀的傳輸毛細管溫度會對離子源噴霧液滴的脫溶劑化及毛細管內(nèi)帶動離子傳輸?shù)臍饬鳡顟B(tài)產(chǎn)生影響[17],因此考察了不同毛細管溫度對信號強度的影響。同樣以50 ng/mL的可卡因溶液做測試,其子離子(m/z182)強度作為考察目標,其中每個數(shù)據(jù)點采樣5次,且每次更換不同探針,其離子信號響應強度與溫度的關系如圖2d所示。當質(zhì)譜毛細管溫度在85～145 ℃范圍內(nèi)時,信號強度隨著溫度的提高而增大,這是因為隨著溫度的升高傳輸毛細管內(nèi)的氣流從湍流變成了層流[18],離子因撞擊到毛細管內(nèi)壁上而造成的損失大大降低。當溫度在145～245 ℃范圍內(nèi),信號強度的曲線波動較小且呈現(xiàn)出緩慢上升的趨勢,說明提高溫度有利于提升脫溶劑化效果,離子在質(zhì)譜內(nèi)的傳輸效率得到提高。這是因為信號強度的提升超過了因溫度升高擴散作用增強而帶來的損失。當溫度為185～205 ℃時,信號強度相對穩(wěn)定且差異性不大,其中溫度為205 ℃時,RSD相對較小;綜合權衡了質(zhì)譜毛細管加熱裝置的壽命和密封圈的耐熱性后,本工作后續(xù)實驗將質(zhì)譜毛細管溫度設為205 ℃。

綜上,將探針式電噴霧離子源的噴霧電壓設置為1.8 kV,便攜式質(zhì)譜儀的毛細管溫度設置為205 ℃。

2.2 標準溶液檢測

使用50 ng/mL的甲基苯丙胺、氯胺酮、可卡因、O6-單乙酰嗎啡和MDMA 5種單標溶液,在檢測前用等體積乙酸乙酯進行萃取,使用探針蘸取上層有機相直接分析,采用正離子質(zhì)譜模式,并同時記錄MS1和MS2質(zhì)譜數(shù)據(jù),結果如圖3所示?？梢钥吹教结樖诫妵婌F離子源結合便攜式質(zhì)譜儀不僅能夠準確定性目標樣品,而且檢測出的二級子離子也具有較高的信噪比。

圖 3 5種常見毒品標準溶液的MS1和MS2譜圖Fig. 3 MS1 and MS2 spectra of the five common drug standard solutions

2.3 線性范圍、檢出限和回收率

在前述儀器優(yōu)化后的條件下,通過對1.2.1節(jié)中獲得的1、4、8、10、20、40、50、100 ng/mL的5種毒品稀釋溶液采用1.2.2節(jié)方法進行前處理,每種毒品的每個加標溶液進行5次檢測且每次更換不同探針,其在各自的線性范圍內(nèi)響應關系如表2所示。從表2中可以看到,尿液基質(zhì)加標的5種毒品質(zhì)譜信號呈現(xiàn)良好的線性關系,甲基苯丙胺、氯胺酮、MDMA、可卡因毒品的子離子信號強度和質(zhì)量濃度之間的相關系數(shù)(R2)均大于0.99,線性關系良好,說明該尿液前處理方法與聯(lián)用檢測平臺結合使用具有優(yōu)良的檢出能力。

表 2 尿液基質(zhì)中5種常見毒品的線性范圍、相關系數(shù)和相對標準偏差(n=5)Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (R2), and RSDs of the five common drugs in urine matrix (n=5)

為了驗證1.2.2節(jié)前處理方法的有效性,使用探針式電噴霧離子源聯(lián)用便攜式質(zhì)譜儀檢測平臺分別對空白尿液樣本進行了常規(guī)5種毒品不同水平的加標回收測試?？瞻啄蛞褐懈魑镔|(zhì)的加標水平分別為10、50、100 ng/mL,各加標樣品均進行5次平行實驗,采用定量子離子強度計算回收率和RSD,結果見表3,可以看出在3個水平下的加標回收率為 56.1%～103.7%,相對標準偏差為9.0%～27.8%。以信噪比(S/N)大于或等于3作為判斷是否檢出的依據(jù),5種毒品的檢出限(LOD)為0.5～30 ng/mL,這表明儀器系統(tǒng)具有較高的靈敏度和準確性,對尿液中毒品檢測具有較好的適用性。

表 3 5種毒品在尿液中的加標回收率、相對標準偏差和檢出限Table 3 Recoveries, RSDs, and limits of detection (LODs) of the five drugs spiked in urine samples

2.4 實際尿液樣本測試

針對云南某地社區(qū)戒毒康復中心提供的一批實際尿液樣本(已進行過司法鑒定標準檢測),利用本工作建立的方法進行復檢,進一步驗證其在實際樣品檢測中的適用性。檢測樣本中同時吸食甲基苯丙胺(俗稱冰毒)與嗎啡的樣本數(shù)為5例,吸食冰毒的樣本數(shù)為10例,吸食嗎啡的樣本數(shù)為25例,陰性樣本數(shù)為110例。

采用聯(lián)用檢測平臺完成所有樣本的檢測耗時為55 min,無論對單個樣本中的一種毒品還是多種毒品的檢測耗時均不超過20 s。檢測結果表明,5例多組分混檢(multi-component detection)的樣本(其中含有冰毒和嗎啡兩種毒品)均能夠在所開發(fā)的尿液前處理方法下使用聯(lián)用檢測平臺準確檢出,僅1例嗎啡的陽性樣本未檢出,其他樣本檢測結果均與司法鑒定標準檢測結果一致,整體的檢測準確率超過99%。嗎啡樣本檢測結果之所以存在未檢出的現(xiàn)象,這可能是因為該物質(zhì)在人體內(nèi)與葡萄糖醛酸容易結合形成嗎啡-3-葡萄糖醛酸苷等其他物質(zhì)[19],影響到該目標物的檢測。

總體而言,利用聯(lián)用檢測平臺結合所建立的尿液前處理方法,不僅檢測所需時間短而且能對樣本目標物進行混檢,能夠適用于實際尿液樣本的檢測并具有較高的準確率,其對甲基苯丙胺的檢出限接近司法鑒定檢測標準[20],且所有常規(guī)毒品檢出限都遠低于膠體金行業(yè)標準(GA/T 1666-2019, YY/T 1595-2017, GA/T 1668-2019, GA/T 1692-2020)。

3 結論

本工作基于探針式電噴霧離子源與便攜式質(zhì)譜儀聯(lián)用檢測平臺,考察了探針式電噴霧離子源的噴霧電壓與質(zhì)譜儀毛細管入口溫度對儀器性能的影響,開發(fā)了一套用于尿液生物檢材的前處理技術,驗證了該聯(lián)用檢測平臺結合前處理方法的檢測靈敏度、適用性、定性能力以及對實際樣本的檢測水平和準確性。結果表明該方法具有檢出限低、操作簡便、快速、準確等優(yōu)點,解決了傳統(tǒng)快篩技術存在假陽率高、定量能力不足的問題,并針對實驗室質(zhì)譜技術在快速檢測中存在的前處理復雜、檢測耗時長、使用環(huán)境苛刻等問題給出了有效替代方案,可進一步拓寬敞開式直接電離質(zhì)譜技術在現(xiàn)場快速檢測領域中的應用,并可作為現(xiàn)場吸毒人員快速篩查的有力“武器”,提升一線實戰(zhàn)水平,為健康中國、平安中國建設做出貢獻。