凝膠中熒光顆粒原位電泳洗脫過量異硫氰酸熒光素用于圖像分析

陳國(guó)宏, 郭澤華, 曹毅仁, 樊柳蔭, 劉偉文,馬藝馨, 曹成喜,2*, 張 強(qiáng)*

(1. 上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院, 上海 200240; 2. 上海交通大學(xué)附屬上海第六人民醫(yī)院,上海 200240; 3. 上海交通大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新中心, 上海 200240)

微納米顆粒具有高的比表面積適合表面修飾[1,2],常用于核酸[3]、聚合物[4]、糖類[5]和蛋白質(zhì)[6]等的靈敏檢測(cè)分析。熒光成像可以探測(cè)免疫檢測(cè)中熒光顆粒的位置[7,8]、平板凝膠中測(cè)定蛋白質(zhì)或核酸條帶[9,10]以及凝膠基質(zhì)中染料的解吸附[11-13]。免疫熒光檢測(cè)通常需要對(duì)顆粒標(biāo)記熒光探針,如異硫氰酸熒光素(FITC),用于指示生物[14-16]或非生物分子[17,18]的結(jié)合或捕獲。為此,各種熒光探針被開發(fā)用于生物目標(biāo)物的標(biāo)記[19-21]。在標(biāo)記過程中經(jīng)常面臨的一個(gè)問題是需要去除多余的染料探針,防止其產(chǎn)生的高背景熒光降低檢測(cè)靈敏度[22]。目前常用的去除多余熒光染料的方法包括凝膠過濾[23]、透析[24]和電-膜萃取[25]。對(duì)于凝膠中的熒光顆粒,可通過連續(xù)洗滌進(jìn)行純化,但效率較低[9-13]。過濾和透析對(duì)懸浮液中游離熒光探針的清除高效且低成本,但需要反復(fù)洗滌。尤其是基于流場(chǎng)驅(qū)動(dòng)的反復(fù)洗滌難以高效地去除顆粒表面非特異性吸附的熒光探針[23,24]。電-膜萃取[25]結(jié)合液相微萃取和電泳的優(yōu)點(diǎn),從標(biāo)記的人血清白蛋白(HSA)中高效地去除游離FITC,但是攔截蛋白質(zhì)需要依賴膜孔徑,且昂貴的濾板和濾膜等耗材導(dǎo)致純化成本較高。上述方法或多或少需要面臨耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、設(shè)備依賴性強(qiáng)等問題。

針對(duì)熒光顆粒的純化,我們發(fā)展了一種電泳洗脫(electrophoretic elution, EE)模型,用于洗脫固定在凝膠基質(zhì)中熒光標(biāo)記顆粒上的多余熒光染料。用磁珠(MBs)、牛血清蛋白(BSA)和FITC分步合成熒光顆粒(MBs-BSAFITC),將MBs-BSAFITC溶液與凝膠混合后注入電泳通道(圖1a)。將電泳管安放在電泳裝置中進(jìn)行EE,并用CCD相機(jī)成像(圖1b)。通過記錄EE前、后通道內(nèi)的熒光圖像定量分析游離FITC的清除率(圖1c)。構(gòu)建的EE模型可以模擬凝膠中基于顆粒的免疫測(cè)定、免疫電泳中抗原抗體結(jié)合或電泳中蛋白質(zhì)熒光染色等場(chǎng)景。

圖 1 可熒光成像的電泳洗脫原理圖Fig. 1 Schematic of electrophoresis elution (EE) with fluorescence imaging a. fluorescent labeling process; b. schematic of in-site EE model; c. schematic of the change in fluorescent signal.BSA: bovine serum albumin; FITC: fluorescein isothiocyanate; I: intensity of fluorescent signals.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

DYY-2C雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀電源(北京六一生物科技有限公司),電泳儀(伯楷安生物科技有限公司),CCD相機(jī)(Olympus,日本)。

N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉購(gòu)自麥克林試劑。BSA、低凝聚溫度瓊脂糖、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、磷酸鹽緩沖液粉劑購(gòu)自Sigma-Aldrich。羧基磁珠(20 mg/mL,直徑4.5 μm,蛋白質(zhì)結(jié)合率(P/MB) 10～40 μg/mg)購(gòu)自PuriMag Biotech。FITC購(gòu)自羅恩試劑。離心管(EP管)購(gòu)自Eppendorf。

配制40 mg/mL的BSA溶液用于MBs的蛋白偶聯(lián)。每次活化羧基磁珠前,先用嗎啉乙磺酸緩沖液(MEST,含0.01% Triton X-100, pH 6.0)分別制備50 mg/mL的EDC和NHS溶液。用7.56 g碳酸氫鈉、1.06 g碳酸鈉和7.36 g氯化鈉制備1 L的交聯(lián)反應(yīng)液。低凝聚溫度的瓊脂糖(10 g/L)用于固定磁珠?；旌喜襟E都在同一振蕩儀(購(gòu)自拓普森儀器有限公司)上完成。

1.2 蛋白偶聯(lián)

取10 μL磁珠溶液到2 mL EP管,用200 μL MEST清洗3次,每次用磁鐵將磁珠吸附于EP管壁并移除上清液。在EP管中分別加入100 μL 50 mg/mL EDC和NHS溶液以及1 800 μL MEST。將EP管置于振蕩儀上,在黑暗環(huán)境中振蕩30 min。羧基被活化后,棄去上清液,并用200 μL MEST洗滌。加入400 μL BSA溶液和1 600 μL MEST,振蕩EP管10 h。孵育結(jié)束后,棄去上清液,即得到MBs-BSA。

1.3 FITC標(biāo)記

向裝有MBs-BSA的EP管中加入600 μL的FITC(1 mg/mL)和1 400 μL交聯(lián)反應(yīng)液,將EP管置于4 ℃暗場(chǎng)環(huán)境孵育8 h。結(jié)束后利用磁鐵去除上清液(此時(shí)管中剩余溶液5 μL),加入50 μL磷酸鹽緩沖液(PBST,含0.01% Triton X-100, pH 7.4)復(fù)溶。將MBs-BSAFITC溶液與液態(tài)瓊脂糖凝膠(10 g/L)混合(兩者體積比為1∶5),將150 μL混合凝膠與空白凝膠分段填入3 mm玻璃管。用CCD相機(jī)記錄電泳通道內(nèi)的熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與討論

圖2a顯示了通道內(nèi)凝膠填充圖像(圖2a上)和EE前(圖2a中)、后(圖2a下)目標(biāo)凝膠段的熒光圖像。圖2b是目標(biāo)凝膠段熒光圖像轉(zhuǎn)化為灰度強(qiáng)度值的側(cè)視圖。EE前,大部分MBs-BSAFITC的熒光被背景熒光覆蓋。EE后,游離FITC被洗脫降低了背景熒光強(qiáng)度,相當(dāng)數(shù)量的熒光顆粒得以顯現(xiàn)。圖2c顯示了熒光圖像中可被裸眼觀測(cè)的最亮和最暗顆粒的灰度強(qiáng)度,EE前的顆粒熒光灰度值較大但與背景區(qū)分度小。EE后,顆粒熒光灰度值減小,但與背景的區(qū)分度明顯增大,微弱熒光顆粒更容易被檢測(cè)到。如圖2d所示,顆粒和背景熒光信號(hào)灰度強(qiáng)度值分別從154.9和142.9降低到43.1和3.5。給定游離FITC的清除率為EE前、后通道內(nèi)背景熒光灰度強(qiáng)度減少的百分比,顆粒熒光保留率為EE前、后的顆粒熒光灰度強(qiáng)度比值[25]。據(jù)此,顆粒熒光保留了27.8% (43.1/154.9),而通道內(nèi)背景熒光減少了97.6% ((142.9-3.5)/142.9)。EE后,顆粒與背景的信號(hào)強(qiáng)度比值(PBr)從1.08 (PBr=154.9/142.9)增加到12.2 (PBr=43.1/3.5)。

圖 2 目標(biāo)凝膠段的熒光圖像以及相關(guān)灰度數(shù)據(jù)Fig. 2 Fluorescent images of the target gel segment and relevant grayscale data a. picture of the filled EE channel (upper), fluorescent images of the target gel segment before (middle) and after (lower) EE (captured using CCD at 488-nm excitation, 525-nm emission, and 1.35-s exposure time); b. side view of the grayscale intensity of the target gel segment; c. grayscale intensity of different brightness particles; d. average gray intensity before and after EE. PBE1 and PBE2: bright and dim particles before EE, respectively; PAE1 and PAE2: bright and dim particles after EE, respectively.

激發(fā)光(488 nm)照射下,FITC發(fā)出的熒光強(qiáng)度可簡(jiǎn)單表示為濃度的函數(shù)[26](IFITC=K·cFITC,給定檢測(cè)系統(tǒng)后可認(rèn)為K為常數(shù))?？紤]曝光時(shí)間(Δt)影響[27],圖像熒光強(qiáng)度可表示為Iim=IFITC· Δt=K·cFITC·Δt。

磁珠上的熒光清除率為72.2% ((154.9-43.1)/154.9),洗脫后顆粒熒光強(qiáng)度明顯下降,可能原因是顆粒熒光包含3個(gè)部分:MBs-BSAFITC上有效標(biāo)記的FITC,吸附在顆粒表面的游離FITC,以及顆粒間微體積溶液中的游離FITC。其中,吸附在顆粒表面[28]和微體積溶液中的游離FITC被電泳洗脫,造成顆粒熒光和背景熒光強(qiáng)度下降。結(jié)果表明,電泳洗脫能洗去大部分噪聲信號(hào),同時(shí)保留有效標(biāo)記的FITC熒光信號(hào),提高了熒光信號(hào)的選擇性和檢測(cè)靈敏度。

相同熒光強(qiáng)度的顆粒均勻分布在通道中可以直觀地反映出熒光標(biāo)記物在顆粒上的覆蓋情況[29]。然而磁珠顆粒尺寸分布存在一定范圍,FITC在磁珠表面的結(jié)合不均勻,且MBs-BSAFITC的制備和凝膠灌注過程中存在顆粒的局部聚集。這些現(xiàn)象的出現(xiàn)導(dǎo)致熒光圖像難以用單一閾值來(lái)劃分提取熒光顆粒?？紤]到通道中顆粒分布密度較低,采用灰度強(qiáng)度側(cè)視圖進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)(見附圖S1～S3, https://www.chrom-China.com/)。圖像中亮點(diǎn)數(shù)量和灰度強(qiáng)度值能近似表示FITC含量。

熒光圖像是CCD相機(jī)在給定曝光時(shí)間內(nèi)捕獲熒光信號(hào)的集合。圖3a是電泳洗脫后的目標(biāo)凝膠段在不同曝光時(shí)間下的熒光圖像。曝光時(shí)間越長(zhǎng),圖像熒光強(qiáng)度就越大,可觀察到的熒光顆粒數(shù)量增多。計(jì)算灰度強(qiáng)度側(cè)視圖的峰數(shù)量、總峰面積和平均峰間隔。長(zhǎng)曝光時(shí)間下,背景熒光也會(huì)增加,因此計(jì)算中進(jìn)行基線校正[30](見附圖S4)。圖3b表明,基線校正會(huì)導(dǎo)致灰度峰數(shù)目的損失,這主要是對(duì)背景熒光的過濾所引起的。圖3c中,校正前總峰面積是圖像中達(dá)到強(qiáng)度閾值區(qū)域的面積,校正后的結(jié)果則反映了熒光顆粒的面積。圖3d表明顆粒隨機(jī)散布,基線校正處理對(duì)熒光顆粒分布統(tǒng)計(jì)的均勻性不會(huì)造成影響。

圖 3 不同曝光時(shí)間下的電泳洗脫后熒光圖像以及相關(guān)灰度數(shù)據(jù)Fig. 3 Fluorescent images after EE at different exposure times and relevant grayscale data a. fluorescent images after 30-min EE at different exposure times; b. peak numbers of spots at different exposure times; c. total peak area of grayscale intensity at different exposure times; d. average peak interval at different exposure times.

增加曝光時(shí)間能提高熒光檢測(cè)靈敏度,因?yàn)轭w粒和背景熒光的累積存在差異,PBr有所提高。但過分延長(zhǎng)曝光時(shí)間,通道中殘留的FITC會(huì)讓背景熒光強(qiáng)度同樣增加,PBr趨于穩(wěn)定。因此適當(dāng)延長(zhǎng)曝光時(shí)間(Δt=2.35 s)可以提高熒光顆粒的檢測(cè)靈敏度,得到較高的PBr(PBr=58.72/3.78=15.52) (見附圖S5)。

3 結(jié)論

本文提出的電泳洗脫模型利用凝膠固定顆粒,通過電泳洗脫多余熒光染料,發(fā)展的MBs-BSAFITC熒光圖像檢測(cè)方法可以初步估算多余FITC的去除率。電泳洗脫去除吸附在顆粒表面的FITC和溶液中游離的FITC,提高了熒光顆粒檢測(cè)方法的特異性和靈敏度。適當(dāng)增加曝光時(shí)間可以提高顆粒和背景信號(hào)比值。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)提高了熒光顆粒檢測(cè)的特異性;(2)快速降低了凝膠中的背景噪聲,提高了檢測(cè)靈敏度;(3)清除游離FITC的效率高,超過97%。該模型可用于清除熒光標(biāo)記顆粒、免疫電泳中蛋白質(zhì)/核酸標(biāo)記以及凝膠電泳中熒光染色等各種不同場(chǎng)景中的多余熒光染料。