冬凌草甲素調(diào)控miR-200c/EZH2 軸抑制黑色素瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

趙汴霞任 紅晉佳路曹 杰?

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥理學(xué)教研室,鄭州 451191;2.山東省青島市市立醫(yī)院藥劑科,山東 青島 266000)

黑色素瘤主要發(fā)端于皮膚中稱為黑色素細(xì)胞的含色素細(xì)胞,其發(fā)生率和死亡率逐年增加[1]。 盡管多數(shù)早期黑色素瘤患者通過(guò)外科手術(shù)的方式得到治愈,但由于其高轉(zhuǎn)移性,晚期惡性患者的5 年生存率僅在5%左右,已知上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用,因此,闡明黑色素瘤的EMT 機(jī)制對(duì)有效控制腫瘤的發(fā)展及治療十分重要[2-3]。 冬凌草甲素是從紅景天中分離出來(lái)的活性成分,具抗炎、抗菌和抗腫瘤的作用,一些研究稱其在皮膚黑色素瘤中顯示出有效的抗癌活性[4]。 多項(xiàng)研究表明微小RNA(miRNA)以癌基因或抑癌基因的作用參與調(diào)控惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,促進(jìn)或抑制腫瘤的EMT過(guò)程[2-3,5]。 miR-200c 作為miRNA 家族的成員,已被發(fā)現(xiàn)其在黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移能力以及耐藥性[6]。 組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer ofzestehomolog 2,EZH2)在黑色素瘤中表達(dá)異常增加,還可作為重要的EMT 誘導(dǎo)劑,參與癌癥的轉(zhuǎn)移[7-8]。 有研究表明,miR-200c 能通過(guò)抑制EZH2 表達(dá)來(lái)抑制腎細(xì)胞癌的進(jìn)展[9]。 因此,本研究旨在探究冬凌草甲素通過(guò)調(diào)控miR-200c/EZH2 軸對(duì)黑色素瘤EMT的影響機(jī)制,以期為黑色素瘤治療機(jī)制研究及治療靶點(diǎn)的尋找提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只SPF 級(jí)7~8 周齡BALB/C 裸鼠(22~24 g)購(gòu)買于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(豫)2017-0001],于河南省中醫(yī)藥研究院[SYXK(豫)2019-0001]進(jìn)行為期1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)(自由飲水、采食、12 h 明暗周期、(24±2)℃)。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)(20190012),符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

冬凌草甲素(上海寶曼生物科技有限公司,貨號(hào):D0348-20 mg,HPLC≥98%標(biāo)準(zhǔn)品);A375 細(xì)胞系(武漢益普生物科技有限公司,貨號(hào):YCL-0014);LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(北京百瑞極生物科技有限公司,貨號(hào):BN17003);BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(武漢純度生物科技有限公司,貨號(hào):CDLG-5055、CDLG-4997);HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗抗體(Invitrogen Antibodies,貨號(hào):A-11001);兔抗β-actin抗體(Abcam,貨號(hào):ab8227);兔抗EZH2、神經(jīng)型鈣黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、鈣粘附蛋白 E ( E-cadherin) 抗體( Cell Signaling Technology,貨號(hào):5246、13116、5741、3195);MTT 檢測(cè)試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司,貨號(hào):ZY111105-500)。 BioSpectrum-美國(guó)UVP 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天放實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自賽默飛世爾。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 A375 細(xì)胞培養(yǎng)

將黑色素瘤細(xì)胞(A375 細(xì)胞)培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)基中(含雙抗和胎牛血清),放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5% CO2、37℃)至細(xì)胞融合度約為80%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 MTT 法檢測(cè)A375 細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375 細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)濃度接種于96 孔板中(每孔100 μL)培養(yǎng)24 h 后,分別添加0、5、10、20、40、80 μmol/L 冬凌草甲素[10](按每毫升培養(yǎng)基添加29.16 μg 冬凌草甲素配置成80 μmol/L 濃度,依次梯度稀釋為40、20、10、5 μmol/L,設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔)培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)基后添加20 μL MTT(5 μg/L)培養(yǎng)4 h,添加二甲基亞砜(200 μL)并震蕩使結(jié)晶溶解,置于酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)吸光度(A490)值,計(jì)算細(xì)胞活力(%)= 處理組A490/對(duì)照組A490×100%。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)置對(duì)照組、冬凌草甲素組(40 μmol/L 冬凌草甲素)、mimic control 組、miR-200c mimics 組、冬凌草甲素+inhibitor control 組、冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375 細(xì)胞接種于6 孔板中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約為80%后按照試劑盒說(shuō)明書操作,將miR-200c 模擬物、抑制劑及其相應(yīng)陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)至A375 細(xì)胞中,再按照分組情況添加40 μmol/L 冬凌草甲素進(jìn)行培養(yǎng)48 h。

1.3.4 qRT-PCR 檢測(cè)miR-200c、EZH2 mRNA 表達(dá)

用TRIzol 法提取轉(zhuǎn)染后A375 細(xì)胞及腫瘤組織中總RNA 并檢測(cè)濃度及純度,后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)qRTPCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增(重復(fù)3 次),通過(guò)GAPDH及U6 作為內(nèi)參分別對(duì)EZH2 和miR-200c基因標(biāo)準(zhǔn)化后使用2-ΔΔCt計(jì)算兩基因表達(dá)情況(表1)。

表1 miR-200c、EZH2 所用qRT-PCR 引物Table 1 qRT-PCR primers for miR-200c and EZH2

1.3.5 免疫印跡法檢測(cè)EZH2 及EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況

添加RIPA 裂解液(500 μL)于冰上將A375 細(xì)胞裂解提取總蛋白,并使用BCA 法定量蛋白后經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳將各蛋白分離,所得分離蛋白低溫轉(zhuǎn)膜后脫脂奶粉封閉(1 h),添加兔抗βactin、EZH2、N-cadherin、Vimentin 及E-cadherin(1 ∶1000)一抗并4℃過(guò)夜,于次日添加已經(jīng)過(guò)稀釋的二抗(1 ∶5000)1 h 孵育后ECL 試劑顯影,于蛋白凝膠成像儀中觀察條帶,并使用Image J 分析條帶灰度值,計(jì)算各個(gè)蛋白含量(重復(fù)3 次)。

1.3.6 黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A375 細(xì)胞黏附能力

使用纖維粘連蛋白(fibronectin)5 μg/mL 包被蓋玻片風(fēng)干后放置到35 mm 培養(yǎng)皿中,添加1.5 mL各組A375 細(xì)胞懸液(每毫升3×105個(gè))1 h 后棄培養(yǎng)基,添加200 μL 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(10 ng/mL)30 min 后使用PBS 終止反應(yīng),多聚甲醛(4%)固定后于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察細(xì)胞黏附數(shù)(每組重復(fù)3 個(gè))。

1.3.7 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A375 細(xì)胞侵襲及遷移能力

遷移能力檢測(cè):將使用RPMI-1640 無(wú)血清培養(yǎng)基所制成的A375 細(xì)胞懸液(每毫升1×105個(gè))接種到Transwell 上室中(100 μL),在下室中加入RPMI-1640 含血清培養(yǎng)基(600 μL),于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,使用棉球?qū)⑸鲜椅创┠さ臍堄嗉?xì)胞擦去,選取5 個(gè)視野對(duì)穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù);侵襲能力檢測(cè):使用經(jīng)膠所包被的Matrigel Transwell 小室上室,其余步驟與上述遷移步驟相同(每組重復(fù)3 個(gè))。

1.3.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-200c 與EZH2 的靶向關(guān)系

首先通過(guò)生物信息學(xué)TargetScan 網(wǎng)址確定miR-200c 與EZH2 結(jié)合位點(diǎn)后構(gòu)建野生型pmirGLOEZH2-wt 載體及突變型pmirGLO-EZH2-mut 載體,將二者分別與miR-200c mimics、miR-NC 進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染,分為:pmirGLO-EZH2-wt+miR-200c mimics 組、pmirGLO-EZH2-wt+ miR-NC 組、pmirGLO-EZH2-mut+miR-200c mimics 組、pmirGLO-EZH2-mut+miR-NC組,48 h 后棄培養(yǎng)基,并經(jīng)過(guò)PBS 清洗后加入細(xì)胞裂解液(200 μL),離心取上清轉(zhuǎn)移至新EP 管中后根據(jù)雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色,檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性。

1.3.9 構(gòu)建移植瘤裸鼠模型及處理

將所購(gòu)買的24 只BALB/C 裸鼠以6 只/組隨機(jī)分為4 組,分為對(duì)照組、冬凌草甲素組、冬凌草甲素+inhibitor control 組、冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組,在裸鼠左側(cè)腋窩外側(cè)皮下注射0.2 mL 1.3.2 中對(duì)照組、冬凌草甲素組、冬凌草甲素+inhibitor control 組、冬凌草甲素+miR-200c inhibitor組細(xì)胞懸液(2×106個(gè)),飼養(yǎng)30 d 后將其處死,取出腫瘤組織并稱取腫瘤質(zhì)量(每組重復(fù)6 個(gè)),取3只裸鼠體內(nèi)腫瘤組織,通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)腫瘤組織中miR-200c、EZH2 表達(dá)情況,取其余3 只裸鼠體內(nèi)腫瘤組織,免疫組化法分析EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況。

1.3.10 免疫組化法分析EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)情況

將所得各組腫瘤組織進(jìn)行多聚甲醛固定,制作常規(guī)組織石蠟切片,二甲苯浸泡5 min 后脫蠟水化,EDTA 緩沖液修復(fù)抗原后添加兔抗N-cadherin、Vimentin 及E-cadherin 一抗,過(guò)夜孵育后添加二抗孵育0.5 h,DAB 顯色、蘇木精復(fù)染、封片、顯微鏡觀察(每組重復(fù)3 個(gè))。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 分析數(shù)據(jù),以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述計(jì)量資料,兩組間比較行t檢驗(yàn),多組間比較行單因素方差分析,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞活力的影響

A375 細(xì)胞存活率隨冬凌草甲素濃度的增加(0、5、10、20、40、80 μmol/L)而顯著降低,其分為100%,(85.15 ± 8.22)%, (70.35 ± 6.63)%, (60.82 ±6.74)%,(47.26±5.70)%,(30.49±4.82)%(P<0.05),存在劑量依賴性,并選取40 μmol/L 冬凌草甲素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞miR-200c、EZH2 mRNA 及EZH2 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組A375 細(xì)胞中miR-200c 表達(dá)水平顯著增加,EZH2 mRNA 及EZH2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖1、2。

注:與對(duì)照組相比,?P<0.05。圖1 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞miR-200c、EZH2 mRNA及EZH2 蛋白表達(dá)的影響Note. Compared with control group, ?P<0.05.Figure 1 Effect of oridonin on the expression of miR-200c,EZH2 mRNA, EZH2 protein in A375 cells

圖2 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞EZH2 蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of oridonin on EZH2 protein expression in A375 cells

2.3 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞EMT 的影響

與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組A375 細(xì)胞中Ncadherin 及Vimentin 表達(dá)水平、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、黏附細(xì)胞數(shù)顯著降低,E-cadherin 表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),見圖3、4、5。

2.4 miR-200c 靶向調(diào)控EZH2 的表達(dá)

TargetScan 網(wǎng)址預(yù)測(cè)顯示:miR-200c 與EZH2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(見圖6);熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,與pmirGLO-EZH2-wt+miR-NC 組(0.91±0.12)相比,pmirGLO-EZH2-wt+miR-200c mimics 組熒光素酶活性(0.47±0.08)顯著降低(P<0.05),而其余兩組熒光素酶活性無(wú)顯著性差異(0.89±0.11 vs 0.90±0.13,P>0.05);與對(duì)照組(1.30±0.24)、mimic control 組(1.29±0.22)相比,miR-200c mimics組EZH2 蛋白表達(dá)水平(0.68±0.10)顯著降低(P<0.05),見圖7。

圖6 miR-200c 與EZH2 的靶向結(jié)合位點(diǎn)Figure 6 Targeted binding sites of miR-200c and EZH2

圖7 miR-200c 過(guò)表達(dá)對(duì)A375 細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)的影響Figure 7 Effect of miR-200c overexpression on EZH2 protein expression in A375 cells

2.5 miR-200c 過(guò)表達(dá)對(duì)A375 細(xì)胞EMT 的影響

與對(duì)照組相比,mimic control 組各指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P>0.05),miR-200c mimics 組A375 細(xì)胞中N-cadherin 及Vimentin 表達(dá)水平、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、黏附細(xì)胞數(shù)顯著降低,E-cadherin 表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),見圖8、9、10。

圖8 miR-200c 過(guò)表達(dá)對(duì)A375 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 8 Effect of miR-200c overexpression on EMT related protein expression in A375 cells

2.6 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)EMT的影響

與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組A375 細(xì)胞中Ncadherin 及Vimentin 表達(dá)水平、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、黏附細(xì)胞數(shù)顯著降低,E-cadherin 表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與冬凌草甲素組相比,冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組N-cadherin 及Vimentin 表達(dá)水平、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)顯著增加,E-cadherin 表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖11、12、13。

2.7 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)腫瘤質(zhì)量的影響

與對(duì)照組(0.54±0.10)相比,冬凌草甲素組(0.15±0.03)腫瘤質(zhì)量顯著降低(P<0.05);與冬凌草甲素組相比,冬凌草甲素+inhibitor control 組(0.16±0.05)無(wú)顯著變化,冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組(0.48±0.12)腫瘤質(zhì)量顯著增加(P<0.05),見圖14。

2.8 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)體內(nèi)腫瘤中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組N-cadherin 及Vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著降低,E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與冬凌草甲素組相比,冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組N-cadherin 及Vimentin 蛋白表達(dá)水平顯著增加,E-cadherin 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖15。

注:與對(duì)照組相比,?P<0.05。圖3 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞EMT 的影響Note. Compared with control group, ?P<0.05.Figure 3 Effect of oridonin on EMT of A375 cells

圖4 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of oridonin on EMT related protein expression in A375 cells

圖5 冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞侵襲及遷移的影響Figure 5 Effect of oridonin on invasion and migration of A375 cells

圖15 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)腫瘤組織中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 15 miR-200c expression silencing reverses the effect of oridonin on the expression of EMT-relatedproteins in tumor tissues

2.9 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)體內(nèi)腫瘤中miR-200c、EZH2 mRNA 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比,冬凌草甲素組EZH2 mRNA表達(dá)水平顯著降低,miR-200c 表達(dá)水平顯著增加(P<0. 05);與冬凌草甲素組相比,冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組EZH2 mRNA 表達(dá)水平顯著增加,miR-200c 表達(dá)水平顯著降低(P<0. 05),見圖16。

注:與對(duì)照組相比,?P<0.05。圖9 miR-200c 過(guò)表達(dá)對(duì)A375 細(xì)胞EMT 的影響Note. Compared with control group, ?P<0.05.Figure 9 Effect of miR-200c overexpression on EMT of A375 cells

圖10 miR-200c 過(guò)表達(dá)對(duì)A375 細(xì)胞侵襲及遷移的影響Figure 10 Effect of miR-200c overexpression on invasion and migration of A375 cells

注:與對(duì)照組相比,?P<0.05;與冬凌草甲素組相比,#P<0.05。圖11 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)EMT 的影響Note. Compared with control group, ?P<0.05. Compared with oridonin group, #P<0.05.Figure 11 miR-200c silencing reverses the effect of oridonin on EMT

注:A:對(duì)照組;B:冬凌草甲素組;C:冬凌草甲素+inhibitor control組;D:冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組。圖13 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Note. A, Control group. B, Oridonin group. C, Oridonin+inhibitor control group. D, Oridonin+miR-200c inhibitor group.Figure 13 miR-200c silencing reverses the effect of oridonin on EMT related protein expression

注:A:對(duì)照組;B:冬凌草甲素組;C:冬凌草甲素+inhibitor control組;D:冬凌草甲素+miR-200c inhibitor 組。圖14 腫瘤形態(tài)觀察Note. A, Control group. B, Oridonin group. C, Oridonin + inhibitor control group. D, Oridonin + miR-200c inhibitor group.Figure 14 Tumor morphology observation

注:與對(duì)照組相比,?P<0.05;與冬凌草甲素組相比,#P<0.05。圖16 miR-200c 表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)腫瘤組織中miR-200c、EZH2 mRNA 表達(dá)的影響Note. Compared with control group, ?P<0.05. Compared with oridonin group, #P<0.05.Figure 16 miR-200c expression silence reverses the effect of oridonin on the expression of miR-200c and EZH2 mRNA in tumor tissues

3 討論

黑色素瘤近年來(lái)發(fā)病率不斷增加,盡管采用標(biāo)準(zhǔn)療法和新療法在疾病治療中取得了很大的進(jìn)展,但患者預(yù)后仍不理想[11-13]。 上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞的EMT 過(guò)程在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用,是腫瘤進(jìn)展必要事件之一[4]。 因此,需要迫切尋找用于抑制黑色素瘤EMT 過(guò)程的新的治療手段,而目前低毒性新的治療藥物是研究重點(diǎn)[11]。

冬凌草甲素是從紅景天中提取的一種重要的中藥活性成分之一,至今,其抗癌活性已得到了廣泛研究,一些報(bào)告稱其在黑色素瘤中通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡抑制來(lái)?yè)p害黑素瘤細(xì)胞的存活和增殖能力[4,12,14]。 冬凌草甲素可通過(guò)抑制EMT 及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)來(lái)有效抑制A375 細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[10]。 冬凌草甲素可通過(guò)抑制粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)信號(hào)通路激活達(dá)到抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H1688)的遷移和EMT 的目的[15]。 冬凌草甲素可通過(guò)抑制蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路來(lái)抑制EMT[16]。 本研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素以劑量依賴性的方式顯著降低A375 細(xì)胞存活率,與前人研究結(jié)果相一致,該結(jié)果表明冬凌草甲素對(duì)黑色素瘤具有有效抑癌作用。 腫瘤在侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中可對(duì)宿主的組織成分產(chǎn)生黏附作用,因此其黏附能力與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系[10]。 在EMT 過(guò)程中E-cadherin 表達(dá)異常降低,而Vimentin和N-cadherin 表達(dá)異常增加[17]。 本研究還發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素可顯著增加E-cadherin 表達(dá)水平,顯著降低N-cadherin 及Vimentin 表達(dá)水平、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、黏附細(xì)胞數(shù),該結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致,這表明冬凌草甲素能通過(guò)增加E-cadherin 表達(dá),降低N-cadherin 及Vimentin 表達(dá)來(lái)抑制A375 細(xì)胞的EMT,以此達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的,提示冬凌草甲素有作為黑色素瘤靶向治療藥物的潛能。

miRNA 通過(guò)與靶mRNA 的3’UTR 結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)mRNA 的翻譯抑制或降解,已成為各種真核生物中基因表達(dá)的有效調(diào)節(jié)劑,并且已被證實(shí)是黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,參與調(diào)控腫瘤的EMT 過(guò)程[18]。 原發(fā)性皮膚黑色素瘤中miR-200c 表達(dá)下調(diào)預(yù)示患者預(yù)后不良[19]。 上調(diào)miR-200c 的表達(dá)可通過(guò)抑制E 盒結(jié)合鋅指蛋白1 和Vimentin 表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌MDA231 細(xì)胞遷移及EMT[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),EZH2 是miR-200c 的潛在靶基因。 已有研究表明,EZH2 在黑色素瘤中表達(dá)異常上調(diào),促使腫瘤的生長(zhǎng)方式更具侵略性、惡性程度更高、預(yù)后更差[21]。miR-200c 表達(dá)沉默可促進(jìn)EZH2 的表達(dá),從而促進(jìn)HCC 細(xì)胞的致瘤性[22]。 本研究發(fā)現(xiàn),本研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素可顯著增加miR-200c 表達(dá)水平,降低EZH2 表達(dá)水平;miR-200c 過(guò)表達(dá)可顯著降低A375細(xì)胞中N-cadherin 及Vimentin 表達(dá)水平、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、黏附細(xì)胞數(shù),增加E-cadherin 表達(dá)水平,與前人研究結(jié)果相似,該結(jié)果表明miR-200c過(guò)表達(dá)可顯著抑制A375 細(xì)胞EMT 發(fā)生,提示,miR-200c/EZH2 軸有作為黑色素瘤潛在治療靶點(diǎn)的可能。 除此之外本研究還發(fā)現(xiàn),miR-200c 表達(dá)沉默則可逆轉(zhuǎn)冬凌草甲素對(duì)A375 細(xì)胞EMT 的抑制,上述結(jié)果表明,冬凌草甲素能夠增加E-cadherin 表達(dá),降低N-cadherin 及Vimentin 表達(dá),以此對(duì)A375 細(xì)胞EMT 起到抑制作用,該機(jī)制可能與其促進(jìn)miR-200c表達(dá)、降低EZH2 表達(dá)有關(guān)。

綜上,冬凌草甲素可能通過(guò)促進(jìn)miR-200c/EZH2 軸來(lái)增加E-cadherin 表達(dá),降低N-cadherin及Vimentin 表達(dá),以此抑制A375 細(xì)胞的EMT 過(guò)程,從而達(dá)到抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的目的。 本研究不僅為黑色素瘤治療靶點(diǎn)的尋找提供依據(jù),還為冬凌草甲素在裸鼠體內(nèi)抑制A375 腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移或小鼠體內(nèi)對(duì)抑制黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的研究提供基礎(chǔ)。