脊髓損傷小鼠中甘草苷通過抑制MAPK通路抑制炎癥和神經(jīng)元凋亡

邵楊，安丹薔，楊楊，戴奇，姜曼玉，孫永新，徐愛華

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，沈陽 110001；2.北京市紅十字會和平骨科醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，北京 100161）

脊髓損傷非常常見且預(yù)后不良，據(jù)報道創(chuàng)傷性脊髓損傷的患病率為236/100萬～4 187/100萬［1］。脊髓損傷輕者喪失勞動力，重者肢體癱瘓，大小便失禁，喪失日常生活自理能力，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。研究［3］揭示，脊髓損傷的病理生理機制主要分為兩大連續(xù)階段，第一階段包括最初的機械損傷，隨之繼發(fā)的缺血缺氧損傷、電解質(zhì)紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)蓄積、細胞壞死和凋亡、神經(jīng)炎癥等一系列級聯(lián)瀑布反應(yīng)為脊髓損傷的第二階段。然而，目前尚無有效的治療策略控制脊髓損傷的進展。因此，有必要尋找和開發(fā)新的治療方法和藥物，以減輕脊髓損傷。

甘草苷是從傳統(tǒng)中藥甘草中提取的一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性和潛在的應(yīng)用前景，如預(yù)防炎癥、緩解疼痛、營養(yǎng)神經(jīng)和保護神經(jīng)等［4］。先前的研究［5］報道，甘草苷對大腦中動脈閉塞所致的局灶性腦缺血再灌注有神經(jīng)保護作用。近期研究［4］發(fā)現(xiàn)，甘草苷對小鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷導(dǎo)致的神經(jīng)性疼痛有保護作用，并且這種作用可能與甘草苷對受損神經(jīng)的直接保護作用和在脊髓水平的抗炎作用有關(guān)。然而，甘草苷對脊髓損傷的神經(jīng)保護作用尚未見報道。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），是一組在調(diào)控促炎性細胞因子表達中起重要作用的信號分子［3］。ERK/p38 MAPK/JNK信號通路在調(diào)節(jié)炎癥、氧化應(yīng)激和細胞凋亡方面發(fā)揮重要作用［6］，該信號通路的激活有助于脊髓損傷后炎癥驅(qū)動的神經(jīng)組織學(xué)破壞和神經(jīng)元凋亡，從而加重脊髓損傷進展［6-7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，甘草苷可通過抑制MAPK信號通路，對心肌纖維化發(fā)揮保護作用。然而，甘草苷能否通過抑制MAPK信號通路抑制脊髓損傷后炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡仍不清楚。因此，本研究探討了甘草苷對脊髓損傷的保護作用，及其與炎癥反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：48只雌性C57BL/6小鼠，6～8周齡，購自遼寧長生生物科技有限公司。小鼠于空調(diào)動物房飼養(yǎng)，動物房內(nèi)環(huán)境溫度為（22±1）℃，相對濕度為45%～55%，光照時間為12 h/12 h明暗交替。實驗期間小鼠自由進食飲水。所有實驗均經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑：甘草苷（美國MCE公司）；全蛋白提取試劑盒、JNK抗體、p-JNK抗體、p38 MAPK抗體、p-p38 MAPK抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、內(nèi)參抗體β-actin（沈陽萬類生物科技有限公司）；NeuN抗體、caspase 3抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG（美國英杰生命技術(shù)有限公司）；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（英國Abcam公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木精（北京索萊寶科技有限公司）；曙紅Y［生工生物工程（上海）股份有限公司］；In Situ Cell Death Detection Kit（紅光）（瑞士羅氏公司）；甲酚紫（中國國藥集團）。

1.1.3 主要儀器：紫外可見分光光度計（UV752N，上海佑科儀器儀表有限公司）；電泳儀（DYY-7C，北京市六一儀器廠）；顯微鏡（BX53，日本OLYMPUS公司）；石蠟切片機（RM2235，德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 脊髓損傷小鼠模型的建立［9］：將小鼠適應(yīng)性飼喂1周后，腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，隨后以T10椎板為中心，切開皮膚，鈍性剝離椎旁肌肉，暴露T9～11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，采用重3 g、直徑1.5 mm的撞擊器，從2.5 cm高度對暴露的脊髓進行撞擊，以產(chǎn)生中度挫傷性損傷。損傷部位存在挫傷、雙下肢抽搐和尾巴痙攣性搖擺為造模成功的標(biāo)志。Sham組只進行T10椎板切除術(shù)，不撞擊。術(shù)后立即腹腔注射0.5 mL生理鹽水（100 μL/20 g）和丁丙諾啡（50 μg·kg-1·d-1），之后1次/d，持續(xù)4 d。進行膀胱按摩，2次/d，以防止泌尿系統(tǒng)感染，直到自主排尿。

1.2.2 實驗分組：將48只C57BL/6小鼠隨機分為4組，分別為假手術(shù)組（Sham組）、脊髓損傷模型組（SCI組）、低劑量甘草苷組（LQ-L組）、高劑量甘草苷組（LQ-H組），每組12只。建模后第2天，分別給予LQ-L組和LQ-H組小鼠低劑量（30 mg/kg）和高劑量（60 mg/kg）甘草苷灌胃給藥，Sham組和SCI組給予與LQ-H組同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。

1.2.3 運動功能的評估：每組隨機取6只小鼠，于術(shù)前和術(shù)后1、3、7、14、21 d進行小鼠后肢運動功能評分（Basso Mouse Scale，BMS）。觀察小鼠后肢踝關(guān)節(jié)活動度、協(xié)調(diào)性、腳爪姿態(tài)、軀干穩(wěn)定性和尾巴姿態(tài)。BMS評分為0～9分，評分越低，運動功能障礙越重。由3名獨立評估者采用雙盲法進行評分，每次觀察小鼠4 min，取3名評估者評分的平均值作為最終得分。

1.2.4 HE染色：給藥完成后每組隨機取3只小鼠，腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死，以損傷點為中心，取縱向離損傷點5 mm以內(nèi)的脊髓組織，用4%多聚甲醛固定24 h，包埋切片（切片厚度為5 μm），取縱向距離損傷中心2 mm處的脊髓切片，脫蠟至水后進行HE染色，脫水封片后于40倍鏡下觀察脊髓組織病變面積，相對病變面積（%）=炎癥面積/脊髓面積×100。

1.2.5 比色法測定MPO活性：給藥完成后每組隨機取3只小鼠，腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死，以損傷點為中心，取縱向離損傷點5 mm以內(nèi)的脊髓組織，準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量，按照試劑盒說明書方法操作，將樣品制備成5%的組織勻漿，取制備好的組織勻漿按照說明書依次加入試劑后混勻，60 ℃水浴10 min，取出后立即在波長460 nm處測定各孔吸光度值，計算MPO活性，以間接評估中性粒細胞浸潤情況。MPO活性（U/g組織濕質(zhì)量）=（測定OD值-對照OD值）/（11.3×取樣量）。

1.2.6 TUNEL染色：取上述制備的3只小鼠脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水后利用TUNEL反應(yīng)液染色，DAPI染核后利用熒光猝滅劑封片，于400倍鏡下觀察脊髓組織中細胞凋亡情況。

1.2.7 免疫熒光染色：取上述制備的3只小鼠脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水后利用NeuN和caspase 3（稀釋比例1 ∶100）4 ℃孵育過夜，按照1 ∶200稀釋比例于室溫孵育二抗90 min，滴加DAPI復(fù)染核，熒光猝滅劑封片后于400倍鏡下觀察脊髓組織中NeuN、caspase 3的共定位，分析caspase 3陽性細胞數(shù)量。

1.2.8 Nissl染色：取上述制備的3只小鼠脊髓組織石蠟切片，脫蠟至水后進行甲酚紫染色，冰醋酸乙醇分化、脫水封片后，于400倍鏡下觀察脊髓組織中神經(jīng)元丟失情況。

1.2.9 Western blotting：取上述未經(jīng)固定的3只小鼠的脊髓組織，利用全蛋白提取試劑盒抽提組織總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒定量，按照40 μg蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉進行封閉，4 ℃過夜孵育一抗（JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK、p-ERK、β-actin抗體按照1 ∶500稀釋），按照1 ∶5 000稀釋比例于37 ℃、45 min孵育二抗。ECL底物發(fā)光后，掃描膠片，采用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甘草苷對脊髓損傷小鼠運動功能的影響

術(shù)后第1、3、7、14、21天，與Sham組比較，SCI組和LQ-L組的BMS評分均明顯下降（P<0.01或0.05）。術(shù)后第1天，與Sham組比較，LQ-H組BMS評分明顯下降（P<0.01），而術(shù)后第3、7、14、21天，2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后第14、21天，與SCI組比較，LQ-H組BMS評分明顯升高（P<0.05），而術(shù)后第1、3、7天，2組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后第1、3、7、14、21天，SCI組、LQ-H組與LQ-L組比較，BMS評分的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 4組BMS評分的比較Tab.1 Comparison of the BMS scores among the four groups

2.2 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織病變面積的影響

HE染色結(jié)果顯示：Sham組、SCI組、LQ-L組、LQ-H組脊髓組織相對病變面積分別為（0.00±0.00）%、（49.10±14.65）%、（31.30±8.24）%、（12.52±3.44）%。與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組相對病變面積明顯增加（P<0.01）；LQ-L組、LQ-H組與SCI組比較，LQ-H組與LQ-L組比較，相對病變面積明顯減小（P<0.05或0.01）。見圖1。

圖1 脊髓組織HE染色結(jié)果 ×40Fig.1 Hematoxylin and eosin staining of the spinal cord tissues ×40

2.3 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中中性粒細胞浸潤的影響

將MPO活性作為中性粒細胞浸潤的間接測量指標(biāo)，確定脊髓損傷后的炎癥狀況。與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組MPO活性明顯增加（P<0.05或0.01）；SCI組與LQ-L組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；LQ-H組與SCI組、LQ-L組比較，MPO活性明顯下調(diào)（P<0.05或0.01）。見圖2。

圖2 4組脊髓組織中MPO活性的比較Fig.2 Comparison of the MPO activity in the spinal cord tissues among the four groups

2.4 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中細胞凋亡的影響

TUNEL染色顯示：Sham組脊髓切片上僅有極少量散在的凋亡細胞；與Sham組比較，SCI組、LQ-L組凋亡細胞數(shù)大量增加；與Sham組比較，LQ-H組凋亡細胞數(shù)量增加較少；，LQ-H、LQ-L組與SCI組比較，LQ-H組與LQ-L組比較，凋亡細胞均減少。見圖3。

圖3 4組脊髓組織中細胞凋亡情況 ×400Fig.3 Cell apoptosis in the spinal cord tissues in the four groups ×400

2.5 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中神經(jīng)元丟失的影響

Nissl染色結(jié)果顯示（圖4A）：與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組小鼠脊髓切片中神經(jīng)元細胞密度均降低；LQ-L組、LQ-H組與SCI組比較，LQ-H組與LQ-L組比較，神經(jīng)元細胞密度增加。

免疫熒光染色顯示（圖4B、4C）：與Sham組比較，SCI組、LQ-L組、LQ-H組caspase 3標(biāo)記的神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯增加（P<0.05或0.01）；與SCI組比較，LQ-L組、LQ-H組caspase 3標(biāo)記的神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯減少（P<0.05或0.01）；LQ-L組與LQ-H組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖4 4組脊髓組織中神經(jīng)元丟失情況Fig.4 Loss of neurons in the spinal cord tissues in the four groups

2.6 甘草苷對脊髓損傷小鼠脊髓組織中MAPK通路蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果顯示：與Sham組比較，SCI組、LQ-L組小鼠脊髓組織中p-ERK、p-p38 MAPK和p-JNK蛋白表達明顯上調(diào)（P<0.05或0.01）；與Sham組比較，LQ-H組p-ERK和p-JNK蛋白表達明顯上調(diào)（P<0.05），但p-p38 MAPK蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與SCI組比較，LQ-L組、LQ-H組p-ERK、p-p38 MAPK和p-JNK蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05或0.01）；與LQ-L組比較，LQ-H組p-ERK和p-p38 MAPK蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05），但p-JNK蛋白表達的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖5。

圖5 4組脊髓組織中MAPK通路蛋白的表達情況Fig.5 Expressions of the MAPK pathway proteins in the spinal cord tissues in the four groups

3 討論

本研究結(jié)果表明，甘草苷能顯著改善脊髓損傷小鼠的運動功能，這主要與減少細胞凋亡和炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究［10］報道，脊髓損傷后血脊髓屏障的破壞導(dǎo)致包括中性粒細胞在內(nèi)的細胞浸潤，形成強烈的局部炎癥，導(dǎo)致細胞死亡和永久性神經(jīng)功能障礙。本研究通過HE染色和檢測損傷組織中MPO活性，發(fā)現(xiàn)甘草苷可以顯著減小損傷后的炎癥區(qū)域和降低中性粒細胞的浸潤程度。本研究結(jié)果與既往甘草苷通過抑制炎癥損傷減輕野百合堿誘導(dǎo)的肝竇阻塞綜合征的研究［11］結(jié)果相似，證明甘草苷可通過抑制炎癥損傷和中性粒細胞浸潤，對小鼠脊髓損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

凋亡是脊髓損傷后脊髓的一個顯著特征，表現(xiàn)為細胞核DNA斷裂和caspase激活［12］。本研究在損傷后的小鼠脊髓組織中檢測到凋亡的神經(jīng)元，脊髓損傷后損傷部位的神經(jīng)元可檢測到caspase激活。caspase是凋亡程序的重要執(zhí)行者［13］，其中caspase 3可在各種類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞凋亡過程中被激活，其激活可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵凋亡事件。本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后神經(jīng)元中的caspase 3被激活，表達活化caspase 3的神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，同時Nissl染色結(jié)果也顯示神經(jīng)元密度降低。而在甘草苷治療后，caspase 3活化及神經(jīng)元丟失情況明顯改善。結(jié)果說明，甘草苷對脊髓損傷的緩解作用至少部分是通過減少caspase 3的激活、抑制細胞凋亡實現(xiàn)的。

MAPK通路在脊髓損傷的病理生理學(xué)中起關(guān)鍵作用［3，7］。既往研究［14］表明，脊髓損傷后，MAPK信號通路在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞和星形膠質(zhì)細胞中被激活，并參與調(diào)節(jié)慢性疼痛。脊髓損傷后抑制MAPK通路可顯示不同的結(jié)果，如減輕炎癥或減少凋亡。研究［8］報道，甘草苷可通過抑制MAPK信號通路對心肌纖維化發(fā)揮保護作用。本研究結(jié)果表明，ERK、p38 MAPK和JNK的激活與脊髓損傷有關(guān)。值得注意的是，甘草苷治療顯著降低了脊髓損傷小鼠脊髓組織中ERK、p38 MAPK和JNK的磷酸化。結(jié)果證明，甘草苷在一定程度上是通過阻斷MAPK信號通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，甘草苷可以顯著恢復(fù)脊髓損傷小鼠運動功能；此外，甘草苷顯著抑制脊髓損傷小鼠脊髓組織炎癥和神經(jīng)元凋亡，這些作用主要是通過甘草苷對MAPK通路的抑制作用實現(xiàn)的。本研究結(jié)果提示，甘草苷可能對脊髓損傷具有一定的治療效果。