10種植物醇提物對(duì)木腐菌的抑菌活性篩選*

羅忠友 韋小麗 余麗萍 李利芬 吳志剛 吳 蝶

（貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

木材作為一種可再生的生物質(zhì)材料，因具有色彩明亮、觸感溫潤、紋理美觀、環(huán)?？山到獾葍?yōu)點(diǎn)廣受人們喜愛，被廣泛應(yīng)用于建筑、家具、造船、造紙等領(lǐng)域[1]。截至2020年，我國是世界第一大木材消費(fèi)國和進(jìn)口國，木材需求量達(dá)到7.6億 m3，人工林面積世界第一，但人均森林面積不足世界平均水平的1/4，對(duì)外依存度高達(dá)24%[2]。隨著天然林保護(hù)工程和生態(tài)文明建設(shè)深入推進(jìn)，人民生活水平不斷提高使得木材的需求量激增，導(dǎo)致我國木材緊缺現(xiàn)象日益突出。因人工林材質(zhì)疏松、密度較小極易引起木材腐朽、霉變等使木材使用壽命縮短，每年給我國帶來高達(dá)數(shù)百億元的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)其進(jìn)行防腐處理是緩解國內(nèi)木材供需矛盾、延長木材使用壽命、節(jié)約木材的重要手段。一些傳統(tǒng)木材防腐劑如林丹、五氯酚鈉、銅鉻砷（CCA）等被限制使用。市場(chǎng)上常用的木材防腐劑為ACQ，但其含有的金屬銅離子易流失，可能對(duì)環(huán)境和人體健康造成危害。因此，現(xiàn)階段尋找開發(fā)新型環(huán)保高效的防腐劑成為木材保護(hù)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3-4]。目前，國內(nèi)外新型防腐劑的主要研究方向?yàn)闊o機(jī)硼鹽[5]、有機(jī)殺菌劑[6-7]和植物源木材防腐劑[8-10]。其中，植物源木材防腐劑主要來源于植物細(xì)胞，容易均勻分散在木材內(nèi)部且不易流失，其低毒、高效、可再生、可降解、靶標(biāo)性強(qiáng)等特點(diǎn)是其他天然防腐劑無可比擬的，近年來受到廣大研究者的關(guān)注[11-13]。由于全球植物近50萬種，種類繁多，次生代謝產(chǎn)物超40萬種[14]，一直以來，篩選廣譜殺菌性的植物來源和活性化合物是開發(fā)植物源木材防腐劑的難點(diǎn)和基礎(chǔ)。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，選用已知具有抑菌活性的10個(gè)木本植物干葉，通過比較其乙醇提取物對(duì)4種常見木腐菌的抑制作用，優(yōu)選高效廣譜的抑菌植物來源，以便為后續(xù)開發(fā)木材防腐劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：均來自貴州省花溪區(qū)和臺(tái)江縣，共5科9屬10種（詳見表1），供試部位均為葉片，經(jīng)40 ℃干燥箱烘干至恒重，粉碎過40目篩后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試植物基本信息Tab.1 List of tested plants

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），杭州百思生物技術(shù)有限公司；無水乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；蒸餾水，自制。

菌種：白腐菌，黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）和采絨革蓋菌(Coriolus versieoly)；褐腐菌，密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）和綿腐臥孔菌（Poria vaporaria）；均由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

CJ-20型凈化工作臺(tái)，WGL-230B型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；400Y型多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；YP502A型電子天平，上海浦春計(jì)量儀器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州朗越儀器制造有限公司；JJ-1B型恒溫水浴電動(dòng)攪拌器，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；TD5A型臺(tái)式低速離心機(jī)，鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；冰禹BYA-258布氏漏斗，冰禹（ICEY）實(shí)驗(yàn)室用品；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，RE-6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；GI80TW型立式自動(dòng)壓力蒸氣滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；無菌操作臺(tái)BSC-400型恒溫恒濕箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乙醇提取物制備

準(zhǔn)確稱取20 g植物樣品，以50%乙醇溶液為溶劑按1∶16比例混合倒入500 mL錐形瓶中，50 ℃恒溫水浴攪拌提取60 min后，離心10 min轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，真空泵結(jié)合布氏漏斗減壓過濾收集濾液。將濾液倒入旋蒸瓶使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到膏狀物，置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，稱量并計(jì)算提取率。最后用無菌水將提取物溶解配制成濃度為200 mg/mL的母液，置于4 ℃下冰箱中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑菌活性篩選試驗(yàn)

采用菌絲生長速率之含毒介質(zhì)法對(duì)10種醇提物的抑菌活性進(jìn)行篩選，以無菌水為空白對(duì)照，設(shè)3組重復(fù)。先將供試真菌用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）在平板活化7～10 d，把配制好的PDA培養(yǎng)基置于蒸氣滅菌器中121 ℃滅菌30 min后，轉(zhuǎn)移至無菌操作臺(tái)冷卻至50 ℃左右，使用移液槍吸取醇提物母液按1∶9比例與培養(yǎng)基混合配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，搖晃均勻倒入內(nèi)徑為85 mm的培養(yǎng)皿中，每皿約10 mL，待自然冷卻凝固后制成帶藥平板。將活化后的菌種沿菌落邊緣用直徑0.7 cm打孔器制備菌餅，用接種環(huán)將菌餅放入帶藥平板中央，菌絲面朝下，移入相對(duì)溫度28 ℃和相對(duì)濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。通過十字交叉法采用游標(biāo)卡尺定期測(cè)量不同時(shí)間（3、5 d和7 d）的菌落直徑，計(jì)算其平均值和抑菌率。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果采用Excel軟件計(jì)算菌落平均直徑和抑菌率，并用SPSS 22.0進(jìn)行方差分析（p＜0.05）和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試植物基本信息

供試植物及其乙醇提取物基本信息詳見表1，10種植物的提取率均高于10%。

2.2 對(duì)白腐菌的抑菌活性分析

10種植物乙醇提取物在不同時(shí)間對(duì)2種白腐菌的抑菌效果見表2和表3。當(dāng)菌落培養(yǎng)3 d時(shí)，黃孢原毛平革菌的空白對(duì)照組已長滿培養(yǎng)皿，10種植物對(duì)黃孢原毛平革菌的生長抑制效果顯著，且抑菌率均高于50%，其中飛龍掌血和香樟高達(dá)100%。隨著時(shí)間延長，部分植物乙醇提取物的抑菌效果有明顯下降，其中8種對(duì)黃孢原毛平革菌的抑菌率完全無抑制，說明其提取物活化物的長效性較差。到第7 d時(shí)，對(duì)黃孢原毛平革菌的抑制效果達(dá)到50%以上的植物僅為香樟（100%）和飛龍掌血（81.80%），而閩楠的抑菌效果較差。除閩楠外，其余9種植物提取物均對(duì)采絨革蓋菌具有抑制作用，其中飛龍掌血抑制效果高于50%。隨著時(shí)間延長，部分植物乙醇提取物的抑菌效果明顯下降，而飛龍掌血對(duì)采絨革蓋菌的抑菌率由93.39%下降至71.59%。7 d時(shí)僅飛龍掌血和香樟對(duì)2種白腐菌均有抑菌作用，且抑制效果較好，而柏木、櫸樹、花椒、銀杏和櫸樹5種植物對(duì)2種白腐菌完全無抑制作用。

表2 10種植物醇提物不同時(shí)間對(duì)黃孢原毛平革菌的抑菌分析Tab.2 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants against P. chrysosporium

表3 10種植物醇提物不同時(shí)間對(duì)采絨革蓋菌的抑菌分析Tab.3 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants against C. versieoly

（續(xù)表3）

2.3 對(duì)褐腐菌的抑菌活性分析

由表4和表5可知，濃度為20 mg/mL的10種植物醇提物在測(cè)試的不同時(shí)間段對(duì)2種褐腐菌均有顯著抑制作用。當(dāng)測(cè)試3 d時(shí)，有4種植物對(duì)密粘褶菌和10種植物對(duì)綿腐臥孔菌的抑制率達(dá)到50%以上，其中飛龍掌血、猴樟、香樟、圓柏對(duì)2種菌均有效。到7 d時(shí)，部分醇提物對(duì)褐腐菌的抑制作用有所下降，其中3種植物對(duì)密粘褶菌有效抑制達(dá)到50%，有4種植物對(duì)綿腐臥孔菌抑制效果高達(dá)75%，其中飛龍掌血抑菌率為100%。對(duì)2種褐腐菌抑制效果均在50%以上的植物為飛龍掌血、猴樟和香樟，其中飛龍掌血效果最佳，香樟次之。

表4 10種植物醇提物不同時(shí)間對(duì)密粘褶菌的抑菌分析Tab.4 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants on G. trabeum

表5 10種植物醇提物不同時(shí)間對(duì)綿腐臥孔菌的抑菌分析Tab.5 Bacteriostatic analysis of ethanol extracts from 10 plants on P. vaporaria

2.4 聚類分析

以植物乙醇提取物7 d時(shí)的抑菌率為變量，利用SPSS軟件系統(tǒng)聚類分析得到樹狀圖，如圖1所示。由圖可知，飛龍掌血（1）和香樟（10）的抑菌效力表現(xiàn)最好，櫸樹（3）、猴樟（4）和圓柏（9）表現(xiàn)為中等，其余5種植物的抑菌效果較差。飛龍掌血和香樟乙醇提取物7 d時(shí)對(duì)4種木材腐朽菌的抑菌效果見圖2。與對(duì)照組相比，香樟和飛龍掌血對(duì)4種菌均有抑制作用，香樟對(duì)黃孢原毛平革菌的菌絲生長起到完全抑制作用，飛龍掌血有少量菌絲生長，效果比香樟差；而飛龍掌血對(duì)其他3種菌的抑菌作用均比香樟強(qiáng)。此外，飛龍掌血中含有大量香豆素類、生物堿類、三萜類、黃酮類等生物活性物質(zhì)，具有抑菌、抗氧化、殺蟲等功能[15,16]。飛龍掌血石油醚和乙酸乙酯提取物對(duì)2種金黃色葡萄球菌存在抑制作用，其活性化合物為白屈菜紅堿[17]。飛龍掌血乙醇提取物對(duì)枯草桿菌、痢疾桿菌、啤酒酵母菌有較強(qiáng)抑制作用[18]，也能抑制白色念珠菌的菌絲形成破壞其細(xì)胞壁，其最小抑菌濃度為7.5 g/mL[19]。李在留等[20]通過篩選17種植物醇提物對(duì)藍(lán)變菌可可球二孢的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)飛龍掌血抑菌效果最佳。這些研究說明飛龍掌血提取物對(duì)多種細(xì)菌、木霉菌和木腐菌均有較好的抑菌效果。香樟作為我國傳統(tǒng)抑菌植物，諸多學(xué)者通過研究香樟提取物對(duì)木竹材的防腐防霉機(jī)理、增效、應(yīng)用等方面證實(shí)了香樟具備開發(fā)新型木材防腐劑的潛力[21-27]。

圖1 植物乙醇提取物7 d時(shí)抑菌率聚類分析樹狀圖Fig. 1 Cluster analysis tree of inhibition rate of plant ethanol extract for 7 days

圖2 飛龍掌血和香樟乙醇提取物7 d時(shí)對(duì)4種菌的抑制效果Fig. 2 Inhibitory eあects of T. asiatica and C. camphora ethanol extract on 4 kinds of bacteria after 7 days

3 結(jié)論

不同植物對(duì)不同菌種（或同一菌種）的抑菌作用不同，同一植物因含有的化合物不同對(duì)不同菌種的差異性也比較大。本文篩選了10種植物干葉的乙醇提取物對(duì)2種白腐菌和2種褐腐菌的抑菌活性。結(jié)果表明：在供試濃度為20 mg/mL的條件下，10種植物乙醇提取物在不同時(shí)間對(duì)木腐菌均有一定的抑制效果，但對(duì)褐腐菌的總體抑菌效果較白腐菌強(qiáng)；當(dāng)菌落生長至7 d時(shí)，有6種植物對(duì)白腐菌和褐腐菌均有抑制作用，其中飛龍掌血和香樟對(duì)4種腐朽菌均有抑制效果；飛龍掌血對(duì)4種木腐菌的總體抑菌效果較香樟強(qiáng)，且抑菌率均高于70%；而香樟對(duì)采絨革蓋菌的抑制效果較差，僅對(duì)其他3種菌的抑制效果達(dá)到70%以上。聚類分析結(jié)果顯示，飛龍掌血和香樟對(duì)4種木材腐朽菌的總體抑菌效力表現(xiàn)最好，結(jié)合前人的研究結(jié)果證實(shí)了這2種植物均具有開發(fā)植物源木材防腐劑的潛力。在未來，植物源木材防腐劑是開發(fā)應(yīng)用環(huán)保型木材防腐劑的主流趨勢(shì)，其可從生產(chǎn)廢料（如廢棄農(nóng)作物、工業(yè)廢料等）中獲取原料，并能有效替代有毒化學(xué)防腐劑，通過對(duì)木材的保護(hù)、提高木材利用率、保護(hù)森林資源以及促進(jìn)多領(lǐng)域協(xié)同可持續(xù)發(fā)展達(dá)到多層生態(tài)效應(yīng)的作用。