聚乙二醇和細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)提高玉米花粉管通道法轉(zhuǎn)化效率

李向龍 張中保 張春 鄭登俞 王作平 吳忠義

摘要：為探討花粉管通道法加聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)、加細(xì)胞穿膜肽（CPPs）介導(dǎo)與直接導(dǎo)入外源基因3種方式間的轉(zhuǎn)化率差異，對2種玉米自交系材料京2416和京92進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化并統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，3種方式均能獲得草甘膦抗性植株，在京2416受體中PEG介導(dǎo)較直接導(dǎo)入高0.45百分點(diǎn)，CPPs介導(dǎo)的較直接導(dǎo)入的高0.66百分點(diǎn)，三者間轉(zhuǎn)化率差異達(dá)顯著或極顯著水平;對T0代草甘膦抗性植株P(guān)CR進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)因外源基因丟失或沉默，草甘膦抗性植株未必都含有目的基因，因此田間篩選應(yīng)與PCR檢測相結(jié)合;北京市農(nóng)林科學(xué)院房山轉(zhuǎn)基因基地轉(zhuǎn)化驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種導(dǎo)入方式其草甘膦抗性率和轉(zhuǎn)化率高低順序一致，均為CPPs介導(dǎo)>PEG介導(dǎo)>對照，與海南省三亞市崖城基地轉(zhuǎn)化相同，且CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)二者間差異極顯著，京2416中二者相差0.26百分點(diǎn)，京92中相差0.36百分點(diǎn)。因此，在花粉管通道法轉(zhuǎn)化玉米過程中加入介導(dǎo)物質(zhì)有助于提高轉(zhuǎn)化率，且加CPPs比加PEG更具有優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：玉米;花粉管通道法;介導(dǎo)物質(zhì);轉(zhuǎn)化率;比較分析

中圖分類號：S513.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0091-04

收稿日期：2021-08-19

基金項(xiàng)目：北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)（編號：KJCX20200603、KJCX20200205、KJCX20200407）。

作者簡介：李向龍（1981—），男，內(nèi)蒙古磴口人，碩士，助理研究員，主要從事玉米遺傳育種研究。E-mail：long8888380@126.com。

通信作者：吳忠義，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事玉米分子育種研究。E-mail：zwu22@126.com。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟，眾多轉(zhuǎn)化方法在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。自周光宇報(bào)道花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)以來[1]，該技術(shù)在國內(nèi)被廣泛應(yīng)用，目前已在水稻、小麥等多種作物中應(yīng)用，并獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系[2-5]。研究者在玉米中利用花粉管通道法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，多以在授粉后的玉米花絲上直接加外源基因?yàn)橹鳎D(zhuǎn)化效率不理想。隨著研究的深入，該方法逐漸被優(yōu)化，如在轉(zhuǎn)化過程中添加聚乙二醇（polyethylene-glycol，PEG）或細(xì)胞穿膜肽（cell penetrating peptides，CPPs）作為介導(dǎo)物質(zhì)，來提高其轉(zhuǎn)化率。由于PEG作為一種細(xì)胞融合劑，可引起細(xì)胞膜表面電荷的紊亂并干擾細(xì)胞間的識別，從而介導(dǎo)細(xì)胞間融合或外源DNA分子進(jìn)入原生質(zhì)體[6]，而CPPs作為小分子多肽，可攜帶疏水性大分子（如DNA）進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)并將其帶入細(xì)胞[7]。目前劉銅等用這2種方式進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，均獲得了陽性植株[8-9]，但二者與直接加外源基因進(jìn)行導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化效率是否存在差異尚未見報(bào)道。本研究以直接滴入外源DNA溶液為對照，通過添加CPPs和PEG等2種方式與對照組進(jìn)行轉(zhuǎn)化率差異比較，確定花粉管通道法的最佳導(dǎo)入方法，以期為該方法在玉米遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用中獲得較高轉(zhuǎn)化率提供技術(shù)參考和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 用于轉(zhuǎn)化的玉米自交系為京2416和京92，由筆者所在課題組的實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 018年初在海南省三亞市崖城基地（簡稱“崖城基地”）進(jìn)行花粉管通道法轉(zhuǎn)化，2018年6月在北京市農(nóng)林科學(xué)院房山轉(zhuǎn)基因基地（簡稱“房山基地”）播種T0代，噴施草甘膦除草劑，并對抗性植株自交授粉;為驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，2018年7月在北京基地再次進(jìn)行轉(zhuǎn)化，11月將轉(zhuǎn)化種子在崖城基地進(jìn)行篩選和檢測。

1.1.3 外源DNA制備 60 ng/μL含抗草甘膦Epsps基因的外源DNA溶液由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備并保存。

1.1.4 試驗(yàn)試劑 1 mg/mL CPPs由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;PEG粉劑由生工生物工程（上海）股份有限公司提供;1 mol/L CaCl2溶液由上海金穗生物科技有限公司提供;除草劑選用美國孟山都公司研制的41%草甘膦異丙胺鹽水劑（農(nóng)達(dá)，Rroundup）。

1.2 轉(zhuǎn)化流程及導(dǎo)入方式

花粉管通道法的轉(zhuǎn)化流程為玉米雌穗未吐絲前先套袋，待花絲長至8～10 cm時(shí)進(jìn)行自交授粉并套袋，依據(jù)前期對兩受體材料轉(zhuǎn)化時(shí)間經(jīng)驗(yàn)，授粉18 h后將雌穗頂部苞葉和花絲同時(shí)剪去，為防止溶液外流，將切口處苞葉內(nèi)花絲剪成凹口再進(jìn)行滴入。

1.2.1 直接導(dǎo)入 以直接滴入外源DNA溶液為對照，轉(zhuǎn)化時(shí)將溶液稀釋至30 ng/μL，滴入360 μL，每個(gè)受體轉(zhuǎn)化15穗，重復(fù)3次。

1.2.2 PEG介導(dǎo) 在50 mL離心管中先加入 4 g PEG、14.6 mL滅菌超純水和0.4 mL的1 mol/L CaCl2，再和外源DNA溶液等體積混勻后進(jìn)行導(dǎo)入。轉(zhuǎn)化溶液終濃度、滴入量、轉(zhuǎn)化穗數(shù)及重復(fù)次數(shù)同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 CPPs介導(dǎo) 將CPPs和外源DNA溶液等體積混合后進(jìn)行導(dǎo)入。轉(zhuǎn)化溶液終濃度、滴入量、轉(zhuǎn)化穗數(shù)及重復(fù)次數(shù)同“1.2.1”節(jié)。

1.3 轉(zhuǎn)化后代草甘膦篩選

轉(zhuǎn)化獲得的T0、T1代種子，人工開溝條播，行長4 m，行距30 cm，3次重復(fù)。待幼苗生長至3葉1心期噴施草甘膦除草劑，濃度為200 mg/L。噴藥前統(tǒng)計(jì)出苗數(shù)，噴藥后觀察其藥害反應(yīng)及抗性，10 d后調(diào)查抗性株數(shù)，統(tǒng)計(jì)草甘膦抗性率。

抗性率=抗性植株數(shù)/出苗植株數(shù)×100%。

1.4 目的基因的PCR檢測

采用CTAB法[10]提取3種方式獲得的T0、T1代草甘膦抗性植株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于轉(zhuǎn)基因抗性植株檢測的PCR上游引物為5′-ACAGCACCTTCATCGGCGACGCCTC-3′，下游引物為5′-GCATCTTTCCGTATGATAGGGCATC-3′，目標(biāo)片段長度為292 bp。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ ?min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，獲得PCR產(chǎn)物。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測Epsps基因，根據(jù)目的基因陽性條帶的植株來統(tǒng)計(jì)3種導(dǎo)入方式的轉(zhuǎn)化率。

轉(zhuǎn)化率=陽性植株數(shù)/出苗植株數(shù)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 007軟件和DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同導(dǎo)入方式對幼苗草甘膦抗性表型

由圖1可知，植株對草甘膦藥害反應(yīng)表現(xiàn)一致，抗性植株葉色及長勢正常，不抗植株葉片先變紫，再變黃，最后整株干枯死亡。對比田間篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3種方式草甘膦抗性植株和無抗性植株差異特別明顯，且PEG介導(dǎo)和CPPs介導(dǎo)等2種導(dǎo)入方式獲得的抗性植株表現(xiàn)與對照沒有差異;2個(gè)受體轉(zhuǎn)化后代對草甘膦藥害反應(yīng)一致，抗性植株未出現(xiàn)藥害，葉色鮮綠，植株生長未受影響。

2.2 不同導(dǎo)入方式T0代草甘膦抗性差異比較

由表1可知，T0代2個(gè)受體材料間出苗數(shù)相差較大，主要是由二者間雌穗結(jié)實(shí)粒數(shù)不同造成的。3種方式在房山基地篩選，都獲得了草甘膦抗性植株，它們在2個(gè)受體內(nèi)的抗性率變化趨勢表現(xiàn)一致，均以加CPPs介導(dǎo)最高，分別為1.12%、1.27%;PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法次之，分別為0.91%、0.95%;對照最低，均不高于0.46%。經(jīng)過方差分析可知，CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)之間的抗性率在2個(gè)受體中分別相差0.21、0.32百分點(diǎn)，達(dá)顯著和極顯著水平;2種方式與對照間抗性率差異達(dá)極顯著水平，在京2416受體中與對照相比分別高0.66、0.45百分點(diǎn)，在京92受體中分別高0.82、0.50百分點(diǎn)?？梢姡?種導(dǎo)入方式之間存在差異，且加入介導(dǎo)物質(zhì)后有助于提升花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率。

2.3 T0代草甘膦抗性植株Epsps基因的PCR檢測

以受體基因組DNA和水為陰性對照，質(zhì)粒為陽性對照，對房山基地篩選得到的T0代草甘膦抗性植株進(jìn)行Epsps基因的PCR檢測。由圖2可知，陰性對照和水均未出現(xiàn)特異性條帶，21株抗草甘膦植株得到的陽性片段中有11株約為292 bp的條帶，與目的基因條帶大小一致，初步證明外源目的基因已成功整合到京92轉(zhuǎn)基因植株基因組中。

2.4 不同導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化率差異比較

通過對3種導(dǎo)入方式獲得的T0代草甘膦抗性植株進(jìn)行PCR檢測，平均轉(zhuǎn)化率結(jié)果見表2。結(jié)合表1和表2可知，3種方式的草甘膦抗性株獲得Epsps目的基因陽性條帶數(shù)量略有減少，可能與基因的丟失或沉默有關(guān)，說明田間篩選應(yīng)和室內(nèi)篩選相結(jié)合，以增加結(jié)果的可靠性。通過方差分析可知，三者在受體間的轉(zhuǎn)化率高低順序一致，依次為CPPs介導(dǎo)>PEG介導(dǎo)>對照，CPPs、PEG分別比對照高0.63、0.37百分點(diǎn);同時(shí)對PEG和CPPs等2種導(dǎo)入方式進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)京2416用CPPs介導(dǎo)的平均轉(zhuǎn)化率為0.89%，較PEG介導(dǎo)顯著高0.26百分點(diǎn)，京92用CPPs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率為1.09%，較PEG介導(dǎo)極顯著高0.36百分點(diǎn)，進(jìn)一步說明花粉管通道法轉(zhuǎn)化中用CPPs介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率高于PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率。

2.5 不同導(dǎo)入方式對受體轉(zhuǎn)化率的驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證上述試驗(yàn)結(jié)果，2018年7月在北京基地繼續(xù)以京2416和京92為受體，用3種導(dǎo)入方式對2種材料進(jìn)行花粉管通道轉(zhuǎn)化，獲得的T0代種子在崖城基地播種后進(jìn)行草甘膦篩選，取抗性植株的葉片在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行PCR檢測（表3）。

由方差分析結(jié)果（表3）可知，3種導(dǎo)入方式在崖城基地獲得的T0代植株草甘膦平均抗性率在受體間表現(xiàn)與在房山基地一致，由高到低依次為CPPs介導(dǎo)>PEG介導(dǎo)>對照，且三者間差異達(dá)極顯著水平;平均轉(zhuǎn)化率變化與之相似，CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)等2種方法顯著高于對照，京2416受體中分別高0.61、0.27百分點(diǎn)，京92受體中分別高0.74、0.37百分點(diǎn)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了花粉管通道法在進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，加入介導(dǎo)物質(zhì)可顯著提高其轉(zhuǎn)化效率，且CPPs介導(dǎo)轉(zhuǎn)化率高于PEG介導(dǎo)。

3 結(jié)論與討論

本研究在采用花粉管通道法轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)上，通過外加CPPs、PEG輔助和DNA溶液直接導(dǎo)入3種方式均獲得了草甘膦抗性玉米植株，且三者之間存在顯著或極顯著差異，說明花粉管通道法在轉(zhuǎn)化時(shí)加入CPPs或PEG介導(dǎo)物質(zhì)有助于提高其轉(zhuǎn)化效率。3種導(dǎo)入方式均有抗草甘膦除草劑的植株，但是PCR檢測后含有目的基因的陽性植株有所減少，說明草甘膦除草劑篩選出的抗性植株還要結(jié)合PCR檢測，這樣才能確保轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果的可靠性。

PEG介導(dǎo)、CPPs介導(dǎo)和直接滴入3種導(dǎo)入方法最終都獲得了含Epsps基因的抗性植株，但三者之間有差異，加介導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化率要高于對照，CPPs介導(dǎo)和PEG介導(dǎo)相比，前者可以獲得更高的轉(zhuǎn)化率，京2416中二者相差0.26百分點(diǎn)，京92中則相差0.36百分點(diǎn)，說明花粉管通道法在進(jìn)行玉米轉(zhuǎn)化時(shí)要加入介導(dǎo)物質(zhì)，且以CPPs介導(dǎo)最佳。

在崖城基地對房山基地轉(zhuǎn)化的T0代材料進(jìn)行篩選驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)3種導(dǎo)入方式的除草劑抗性及遺傳轉(zhuǎn)化率高低順序未發(fā)生變化，三者間差異達(dá)極顯著水平。本試驗(yàn)為2地2季的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，3種方式在受體間的差異還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

花粉管通道法利用植物授粉后所形成的花粉管通道將外源DNA攜帶入胚囊，其優(yōu)點(diǎn)是不再依賴組培再生植株，操作簡單，常規(guī)育種工作者易于掌握[11]。在玉米轉(zhuǎn)化過程中，其轉(zhuǎn)化率除受外界環(huán)境因素影響外，更主要的影響因素是轉(zhuǎn)化方法本身，筆者所在課題組在多年的實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)加入介導(dǎo)物質(zhì)可提高玉米的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

本研究采用的3種導(dǎo)入方法都能獲得草甘膦抗性植株，但PCR檢測時(shí)仍存在無陽性條帶的現(xiàn)象，可能是外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，在遺傳過程中會(huì)被細(xì)胞中的核酸酶逐漸降解，進(jìn)而使得基因沉默或丟失，最終導(dǎo)致目的基因不能都在草甘膦抗性植株中表達(dá)，說明在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽性植株檢測時(shí)，除草劑篩選要和PCR檢測相互結(jié)合起來，避免假陽性的出現(xiàn)。

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