微生物耦合CdS 光催化降解磺胺甲唑的機(jī)理研究

陳泉林，梁競文，曾翠平，劉廣立，張仁鐸，駱海萍

（1.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；2.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518055）

產(chǎn)乙酸混菌中細(xì)菌種類豐富，并且存在天然的相互作用，其在代謝過程中的氧化還原反應(yīng)也使其具備降解污染物的巨大潛能。同型產(chǎn)乙酸菌是一類能夠利用乙酰輔酶A 途徑固定CO2的微生物類群，在Cd2+脅迫下，同型產(chǎn)乙酸菌能夠利用自身代謝過程在溫和條件下形成具有特定形態(tài)和結(jié)構(gòu)的CdS 納米顆粒，CdS 在光激發(fā)下產(chǎn)生的電子能夠?yàn)橥彤a(chǎn)乙酸菌提供電子供體，在無其他電子供體存在的情況下實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)酸和光能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)化〔5-6〕，該系統(tǒng)已在能源生產(chǎn)、生物制造等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力。然而，目前關(guān)于SMX 降解的研究多以純菌為主，關(guān)于混合菌群-CdS 耦合系統(tǒng)降解SMX 的研究甚少。

微生物耦合半導(dǎo)體光催化系統(tǒng)能夠結(jié)合微生物的生物催化性能和半導(dǎo)體材料的光催化降解性能，在含多環(huán)芳烴、偶氮染料等廢水的處理中展現(xiàn)出優(yōu)異的降解性能，但關(guān)于這一系統(tǒng)降解藥品和個(gè)人護(hù)理用品（PPCPs）類污染物的效果及機(jī)制研究仍較為欠缺。在產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)中，CdS 具有良好的導(dǎo)電性、較大的比表面積、優(yōu)異的可見光催化性能以及良好的生物相容性，能夠促進(jìn)微生物的光電化學(xué)過程〔6〕。CdS 在可見光激發(fā)下產(chǎn)生的電子和空穴能夠驅(qū)動氧化還原反應(yīng)，將復(fù)雜污染物轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)簡單的中間產(chǎn)物，光催化和生物催化的協(xié)同作用有望實(shí)現(xiàn)SMX 的高效降解。

本研究采用產(chǎn)乙酸混菌構(gòu)建產(chǎn)乙酸混菌-CdS耦合系統(tǒng)，通過SEM、EDS、XRD 表征證實(shí)CdS 在細(xì)菌表面成功合成，考察了該系統(tǒng)對SMX 的降解性能和CdS 濃度對降解效果的影響，利用LC-MS 分別探究了SMX 的生物降解路徑、光催化降解路徑以及在微生物耦合光催化系統(tǒng)中的降解路徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

自養(yǎng)培養(yǎng)基A 成分：0.5 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.412 4 g/L MgCl2·6H2O、0.05 g/L CaCl2、0.458 4 g/L K2HPO4·3H2O、0.23 g/L KH2PO4、2.1 g/L 2-溴乙基磺酸鈉、10 mL微量元素溶液〔1.5 g/L氨三乙酸、3 g/L MgSO4·H2O、0.5 g/L MnSO4·H2O、1 g/L NaCl、0.1 g/L FeSO4·7H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、0.1 g/L CoCl2·6H2O、0.13 g/L ZnCl2、0.01 g/L CuSO4·5H2O、0.01 g/L AlK（SO4）2·12H2O、0.01 g/L H3BO3、0.025 g/L Na2MoO4、0.024 g/L NiCl2·6H2O、0.025 g/L Na2WO4·2H2O〕、10 mL 維生素溶液（2 mg/L 維生素H、5 mg/L 維生素B1、10 mg/L 維生素B6、5 mg/L維生素B2、2 mg/L葉酸、5 mg/L煙酸、5 mg/L泛酸、0.1 mg/L 維生素B12、5 mg/L 對氨基苯甲酸、5 mg/L 維生素B14）。

富集培養(yǎng)基B 成分：0.4 g/L NaCl、0.4 g/L NH4Cl、0.272 2 g/L MgCl2·6H2O、0.05 g/L CaCl2、0.25 g/L KCl、0.8 g/Lβ-甘油磷酸鈉、2.5 g/L NaHCO3、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L 蛋白胨、10 mL 微量元素溶液（成分同上）、10 mL 維生素溶液（成分同上）。

儀器：HZQ-F100 恒溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；NB-1M 磁力攪拌器，蘇州九聯(lián)科技有限公司；P230Ⅱ高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器公司；Orbitrap Fusion Lumos 三合一高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（LC-MS），美國ThermoFisher；Sigma 500 場發(fā)射掃描電鏡，德國Carl Zeiss；Sigma 500 能譜儀，德國Bruker；Ultima ⅣX 射線衍射儀，日本理學(xué)。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用菌種來源

本研究中使用的產(chǎn)乙酸混菌來自實(shí)驗(yàn)室成功馴化與富集的高效產(chǎn)乙酸菌群微生物混合培養(yǎng)物。

1.3 微生物-CdS 耦合系統(tǒng)的構(gòu)建

將產(chǎn)乙酸混菌接種至自養(yǎng)培養(yǎng)基A 中活化培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.2 后，接種5%（體積分?jǐn)?shù)）菌液至富集培養(yǎng)基B 中，通合成氣〔V（H2）/V（CO2）=80/20〕5～10 min 后，放置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d（180 r/min，30 ℃）。微生物富集后，在通合成氣的同時(shí)加入1 g/L 的L-半胱氨酸鹽酸鹽和1 mmol/L Cd（NO3）2溶液，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)3 d。當(dāng)菌液由乳白色變?yōu)辄S色，即表明微生物-CdS 耦合系統(tǒng)成功構(gòu)建。

1.4 光催化降解實(shí)驗(yàn)

產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)離心棄去上清液后重新分散于裝有自養(yǎng)培養(yǎng)基A 的厭氧瓶（18 mL）中，補(bǔ)充1 g/L 的L-半胱氨酸鹽酸鹽，SMX 質(zhì)量濃度為2 mg/L，反應(yīng)液體積為10 mL，在模擬光照（白光燈，波長范圍為442～447 nm，光照強(qiáng)度為50 mW）條件下，將厭氧瓶放置于磁力攪拌器中啟動微生物耦合CdS 光催化降解SMX 實(shí)驗(yàn)。用錫箔紙將厭氧瓶包裹3 層以模擬無光照下微生物降解SMX 的實(shí)驗(yàn)，將微生物滅菌處理以模擬光催化降解SMX 實(shí)驗(yàn)。在反應(yīng)時(shí)間為0、3、6、9、12、24 h 時(shí)分別取樣0.5 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜儀測定SMX 的濃度，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀在正負(fù)離子模式下檢測SMX 的降解產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)的合成

產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)的掃描電鏡表征結(jié)果如圖1 所示。

圖1 產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)的SEM（a）、（b）和EDS（c）、（d）Fig.1 SEM（a），（b）and EDS（c），（d）of the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS

由圖1（a）可見，產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)中存在球形、弧形以及桿狀等形態(tài)的細(xì)菌，這些細(xì)菌表面均勻分布著大量球狀顆粒。由圖1（b）可見，球形顆粒緊密地覆蓋在細(xì)菌表面。對這些球形顆粒進(jìn)行EDS 表征，結(jié)果如圖1（c）、1（d）所示，球狀顆粒的主要組成元素為Cd 和S，且比例接近1∶1，初步證實(shí)CdS 在產(chǎn)乙酸混菌表面成功合成。

產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)的XRD 分析結(jié)果如圖2 所示。

圖2 中26.58°、43.94°和52.08°處出現(xiàn)3 個(gè)峰，分別對應(yīng)于立方體CdS 的（111）、（220）和（311）面，這與標(biāo)準(zhǔn)卡片PDF#42-1411 一致，再次證實(shí)CdS 在產(chǎn)乙酸混菌表面成功合成。X 射線衍射峰寬，說明合成的CdS 晶粒尺寸小〔7-8〕。此外，降解SMX 前后產(chǎn)乙酸混菌-CdS 系統(tǒng)的峰形和峰的位置未發(fā)生明顯偏移，說明該耦合系統(tǒng)不僅能夠有效降解污染物，而且穩(wěn)定性高。

圖2 產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)降解SMX 前后的XRDFig.2 XRD of the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS before and after the degradation of SMX

2.2 產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)對SMX 的去除效果

本研究分別在5 個(gè)條件下探究了產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)對SMX 的降解效果：①微生物+CdS；②滅活微生物+CdS；③微生物；④光解；⑤吸附。其中，①、②、④在光照條件下，③、⑤在避光條件下展開研究；④為將SMX 溶解在自養(yǎng)培養(yǎng)基A 中后在光照下的降解。反應(yīng)時(shí)間為24 h。結(jié)果見圖3。

圖3 產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)在不同條件下對SMX 的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of SMX in the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS under different conditions

如圖3 所示，24 h 內(nèi)產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)（微生物+CdS）能夠完全降解SMX，而微生物單獨(dú)作用下SMX 的去除率為31%，細(xì)菌失活后CdS 光催化劑對SMX 的去除率僅為27%，這初步說明產(chǎn)乙酸混菌在光催化劑降解SMX 過程中發(fā)揮了重要作用，產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)顯示出優(yōu)于單獨(dú)CdS 光催化降解或單獨(dú)生物降解對SMX 的去除效率。

2.3 CdS 濃度對SMX 降解效果的影響

產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)中CdS 的濃度對SMX 的降解效果和反應(yīng)速率有顯著的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 CdS 濃度對SMX 降解效果和反應(yīng)速率的影響Fig.4 The influence of CdS concentration on the degradation efficiency and reaction rate of SMX

由圖4（a）可 見，當(dāng)CdS濃度分別為0.5、1、2、4 mmol/L 時(shí)，雖然SMX 的去除率均隨時(shí)間的延長而增加，但是相同時(shí)間內(nèi)CdS 濃度越高，SMX 去除率越大。CdS 濃度為2 mmol/L 時(shí)，反應(yīng)12 h 后SMX 的去除率便達(dá)到95%；而當(dāng)CdS 濃度提高為4 mmol/L 時(shí)，僅9 h 便能夠完全去除SMX。這可能是由于耦合系統(tǒng)中CdS 濃度增加時(shí)，水中分散的CdS 光催化劑數(shù)量隨之增加，微生物自合成的CdS 在光激發(fā)下產(chǎn)生的空穴和活性氧等自由基的數(shù)量也相應(yīng)增加〔9〕，耦合系統(tǒng)中微生物的活性得到加強(qiáng)，因此CdS 濃度的增加顯著提高了產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)對SMX的降解效果。

此外，由圖4（b）可見，SMX 的降解過程均符合一級反應(yīng)動力學(xué)。隨著CdS 濃度的增加，反應(yīng)速率逐漸增加。CdS 濃度從0.5 mmol/L 提高到1 mmol/L時(shí)反應(yīng)速率的增幅較小，這可能是因?yàn)镃dS 濃度變化較小；當(dāng)CdS 濃度從1 mmol/L 提高至2 mmol/L 和4 mmol/L 時(shí)，反應(yīng)速率常數(shù)從0.123 5 h-1分別提高至0.221 2 h-1和0.359 h-1，說明耦合系統(tǒng)中CdS 濃度的增加顯著提高了SMX 降解的反應(yīng)速率。

2.4 微生物耦合CdS 體系降解SMX 機(jī)制研究

為了明確微生物耦合CdS 體系降解SMX 的機(jī)制，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）正負(fù)離子模式分別對微生物降解、CdS 光催化降解以及微生物耦合CdS 光催化降解SMX 過程中的產(chǎn)物進(jìn)行檢測及對比，從而推導(dǎo)出SMX 可能的微生物降解路徑、光催化降解路徑以及微生物耦合光催化系統(tǒng)降解途徑。

2.4.1 微生物降解路徑

微生物降解過程中，在正離子模式下保留時(shí)間為4.47 min 處檢測到SMX（m/z=254）。依次將正離子模式和負(fù)離子模式下檢測出的中間產(chǎn)物命名為B-SMX1～B-SMX9，根據(jù)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提出了微生物降解過程中可能的2 種代謝路徑，如圖5 所示。

有研究表明，細(xì)菌體內(nèi)的2 種Flavin 依賴性單加氧酶（Sad A、Sad B）和FMN 還原酶（Sad C）的基因參與了SMX 的降解過程〔10〕。如圖5 所示，在降解途徑1 中，SMX 首先被還原為產(chǎn)物B-SMX1（4-苯醌-亞胺）和B-SMX3（3-氨基-5-甲基異唑），之后BSMX1 再被還原為產(chǎn)物B-SMX2（對氨基苯酚），而BSMX3 逐漸失去甲基和氨基，生成產(chǎn)物B-SMX5（異唑）。在降解途徑2 中，SMX 結(jié)構(gòu)中的異唑環(huán)被破壞，N—O 鍵斷開，生成產(chǎn)物B-SMX6，接著BSMX6 的S—N 鍵斷開生成B-SMX7，B-SMX7 側(cè)鏈羥基被取代、斷裂，最終生成產(chǎn)物B-SMX9（苯胺）。這些產(chǎn)物最終經(jīng)過微生物的作用可能被完全礦化為SO42-、NH4+、NO3-、CO2、H2O 等。

圖5 SMX 在產(chǎn)乙酸混菌作用下的可能降解路徑Fig.5 Possible degradation pathways of SMX by the role of homoacetogenic mixed cultures

2.4.2 光催化降解路徑

光催化降解過程中，在正離子模式下共檢測到9 種產(chǎn)物，依次命名為P-SMX1～P-SMX9。根據(jù)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，提出了光催化降解SMX 的4 種可能代謝路徑，如圖6 所示。

圖6 SMX 在CdS 光催化作用下的可能降解路徑Fig.6 Possible degradation pathways of SMX by the role of CdS photocatalysis

產(chǎn)物的差異可能是由于光催化材料產(chǎn)生的活性基團(tuán)攻擊了SMX 不同的結(jié)構(gòu)位置。在E.IOANNIDOU 等〔11〕的研究中，苯環(huán)氨基的羥基化和氧化是SMX 主要的轉(zhuǎn)化途徑，有研究推測，O2·-能夠?qū)⒒前奉惢衔锝Y(jié)構(gòu)中的氨基氧化為硝基〔12〕。如圖6 所示，在路徑1 中，SMX 苯環(huán)上的氨基受到攻擊，被氧化后形成硝基衍生物P-SMX1。在路徑2 中，氨基首先被羥基取代形成產(chǎn)物P-SMX2，之后其異唑環(huán)上的甲基受到攻擊，形成P-SMX3。而路徑3 中SMX 的異唑環(huán)直接被強(qiáng)氧化性的羥基自由基等活性基團(tuán)破壞，形成產(chǎn)物PSMX4。在路徑4 中，羥基自由基對磺酰胺鍵的攻擊導(dǎo)致S—N鍵斷裂，直接形成產(chǎn)物P-SMX5和P-SMX6。前3 種路徑下P-SMX1、P-SMX3、P-SMX4 這3 種不同的初級產(chǎn)物，在隨后的降解過程中S—N 鍵被打開，形成對氨基苯磺酸的羥基衍生物P-SMX5 和P-SMX6（3-氨基-5-甲基異唑），這2 種產(chǎn)物再經(jīng)過進(jìn)一步的氧化還原過程，可能轉(zhuǎn)化為P-SMX7、P-SMX8、P-SMX9這3 種產(chǎn)物。

2.4.3 耦合系統(tǒng)降解路徑

產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合光催化系統(tǒng)在降解SMX 的過程中，不同時(shí)間下均檢測到光催化降解途徑的代謝產(chǎn)物，分別將其命名為H-SMX1～H-SMX9，代謝產(chǎn)物隨時(shí)間的變化如圖7 所示。

圖7 微生物耦合光催化系統(tǒng)降解SMX 的降解產(chǎn)物豐度隨時(shí)間的變化Fig.7 Variation of the abundance of degradation products of SMX with time in the microbial coupled photocatalytic system

由圖7 可知，H-SMX1～H-SMX9 的豐度響應(yīng)值隨時(shí)間發(fā)生變化，其中H-SMX3、H-SMX6、H-SMX9是主要的代謝產(chǎn)物，最終的累積豐度在9 種光催化降解產(chǎn)物中占比最高。結(jié)合圖6 的光催化降解途徑，SMX 苯環(huán)上氨基的羥基化、S—N 鍵的直接斷裂以及甲基的丟失可能是耦合光催化系統(tǒng)中SMX 的主要降解途徑，SMX 在24 h 內(nèi)大多被轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)較為簡單的代謝產(chǎn)物H-SMX9。

圖8 為單一光催化系統(tǒng)和耦合光催化系統(tǒng)降解SMX 的中間產(chǎn)物的豐度對比。其中，P 代表單一光催化，H 代表耦合光催化，數(shù)字1～9 分別代表代謝產(chǎn)物SMX1～SMX9。

圖8 SMX 光催化降解產(chǎn)物豐度在不同條件下隨時(shí)間的變化Fig. 8 Variation of the abundance of photocatalytic degradation products of SMX with time under different conditions

如圖8所示，與耦合光催化系統(tǒng)不同的是，單一光催化降解過程的主要降解產(chǎn)物是P-SMX2、P-SMX3、P-SMX6、P-SMX7、P-SMX9。12 h 內(nèi)單一光催化體系內(nèi)P-SMX2 的豐度迅速增加，而耦合光催化系統(tǒng)中H-SMX2 的豐度保持較低水平且增長緩慢。24 h 內(nèi)H-SMX2 丟失甲基的產(chǎn)物H-SMX3 在耦合光催化系統(tǒng)中的豐度比單一光催化體系增加近2 倍，說明微生物的存在可能促進(jìn)了異唑環(huán)上甲基的去除，使H-SMX2向H-SMX3 轉(zhuǎn)化。此外，產(chǎn)物P-SMX7 在單一光催化體系的降解產(chǎn)物中豐度最高，比耦合光催化系統(tǒng)中H-SMX7的豐度高2個(gè)數(shù)量級，這可能是由于耦合光催化系統(tǒng)中產(chǎn)乙酸混菌將其轉(zhuǎn)化為更為簡單的產(chǎn)物甚至完全礦化為CO2、NH3、H2O 等。作為光催化降解過程的末端產(chǎn)物，反應(yīng)24 h 時(shí)3-氨基異唑（H-SMX9）在耦合光催化系統(tǒng)中的豐度是單一光催化降解產(chǎn)物（PSMX9）豐度的2 倍，這說明耦合系統(tǒng)更利于將SMX 降解為結(jié)構(gòu)簡單的代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

通過在細(xì)菌表面穩(wěn)定合成CdS，成功構(gòu)建了產(chǎn)乙酸混菌-CdS 耦合系統(tǒng)。微生物耦合光催化系統(tǒng)在降解SMX 上的表現(xiàn)優(yōu)于單一光催化降解或生物降解。提高CdS 濃度能夠顯著提升SMX 的降解效果和反應(yīng)速率。微生物耦合CdS 系統(tǒng)在降解SMX時(shí)同時(shí)存在光催化降解和生物降解過程，微生物降解和CdS 光催化協(xié)同促進(jìn)SMX 轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)簡單的產(chǎn)物——3-氨基異唑，發(fā)揮了生物降解和光催化降解的雙重優(yōu)勢。這一系統(tǒng)有望實(shí)現(xiàn)PPCPs 污染物的高效降解，探究其對磺胺甲唑的降解機(jī)制將為該系統(tǒng)的實(shí)際環(huán)境應(yīng)用提供可靠的技術(shù)支持，亦可加深研究者對自然界中太陽光驅(qū)動作用下礦物與微生物之間相互作用的理論認(rèn)知。