基于PSD-95/nNOS通路探討7-NI改善青春期大鼠焦慮樣行為

曹廣文，張燕偉，陶夢超，魏鵬晟，郎文萱，李興怡，金 戈，朱啟文

0 引言

焦慮癥是最常見的精神疾病，其發(fā)病率逐年上升[1]。焦慮癥的發(fā)病年齡通常在兒童或青少年時期，病程通常是慢性復發(fā)[2]。動物研究表明，暴露于母嬰分離(Maternal separation，MS)的后代大腦和行為發(fā)生了改變，包括引起焦慮癥、抑郁癥、社交攻擊性增加[3-5]等。在斷奶后和青春期前后的社會隔離會引發(fā)動物的行為改變和情感障礙，導致成年后動物出現(xiàn)焦慮樣行為、攻擊性增加和認知缺陷[6]。因此，研究治療焦慮癥的藥物具有重要意義，盡管藥物研發(fā)取得了顯著進展，但許多焦慮癥患者仍無法對現(xiàn)有的藥物治療產生足夠的反應[7]。

一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)是一類含血紅素的同工酶，在體內有3種類型的NOS同工酶，即神經元型一氧化氮合酶(Nerve nitric oxide synthase，nNOS)、誘導型一氧化氮合酶和內皮型一氧化氮合酶。在中樞神經系統(tǒng)中，nNOS位于突觸后細胞膜內，并通過突觸后密度95蛋白(Postsynaptic density-95，PSD-95)與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)物理連接。在生理條件下，“突觸” NMDAR的輕度激活使Ca2+大量涌入，Ca2+與鈣調蛋白結合，導致nNOS催化激活，產生的一氧化氮發(fā)揮不同的細胞作用。NMDAR的過度激活可能導致異常的Ca2+流入突觸后神經元，并通過三元NMDAR/PSD-95/nNOS復合物的形成而導致nNOS的過度激活，nNOS過量是誘發(fā)神經系統(tǒng)疾病的主要因素[8]。

本實驗應用選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲哚(7-Nitroindazole，7-NI)干預青春期大鼠類焦慮樣行為，并通過地佐環(huán)平(Dizocilpine，MK801)阻滯NMDARs，探討7-NI治療青春期大鼠類焦慮樣行為的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 采用SPF級成年Sprague-Dawley大鼠雌雄各10只，體重(250±20)g，購自遼寧省沈陽市長生生物有限公司，生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001，按照中華動物倫理學要求飼養(yǎng)和處理動物，購買后雌雄分籠飼養(yǎng)1周適應環(huán)境，之后按照隨機原則一雌一雄合籠飼養(yǎng)，動物房溫度：18～22 ℃，濕度：50%～60%，燈光照射時間為8∶00～20∶00，自由進食飲水，每日檢查雌鼠情況，孕鼠單獨飼養(yǎng)。

1.2 試劑 PSD-95抗體(Cell Signaling Technology公司，編號：sc32290)；nNOS抗體(Affinity Biosciences公司，批號：1560366)；一抗稀釋液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號：20201115)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(上海碧云天生物技術有限公司，批號：010719190418)

1.3 儀器及裝置 多功能閉合式迷宮裝置(沈陽醫(yī)學院)；曠場箱；懸尾架；酶標定量測試儀；-80 ℃低溫冰箱；低溫超速離心機(美國BECKMAN 公司)；高通量勻漿機；垂直電泳儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動物建模 將10只母鼠在同一時期產下的90只仔鼠按照雌雄各半、同窩對照的原則隨機分為MS組和對照組，分娩當天命名為PND0(Postnatal day 0)，MS組：從PND1至PND21，每天與母鼠連續(xù)分離6 h，分離前更換分離組子代大鼠籠墊料，檢查子代大鼠身體狀況[9-10]。PND21仔鼠斷奶后，MS組大鼠在PND21～PND39[11]期間單獨一個籠子孤養(yǎng)，對照組：正常飼養(yǎng)至實驗前。

2.2 動物分組及給藥 實驗前將造模后健存的(因母鼠棄養(yǎng)而死亡4只)子代MS組大鼠進行再次篩選分組，共分為5組，每組12只：分別為模型組、7-NI 25 mg組、7-NI 50 mg組，MK801+7-NI 25 mg/kg組。同樣，對照組仔鼠按照相同原則只保留12只作為實驗對象。剩余仔鼠不參與本次實驗。對照組和模型組均腹腔注射溶劑即1%的DMSO 25 mg/kg；7-NI 25 mg組和7-NI 50 mg組分別按照25 mg/kg和50 mg/kg注射7-NI；MK801+7-NI 25 mg/kg組先按照0.075 mg/kg注射MK801，15 min后注射25 mg的7-NI。注射時間均為每天行為學進行前1 h[12-14]，實驗流程如圖1所示。

圖1 實驗流程

2.3 實驗方法

2.3.1 曠場實驗 將單只大鼠放入自發(fā)活動觀察箱內(長50 cm，寬50 cm，高40 cm)，箱體底部被分割成中央?yún)^(qū)和外周區(qū)。箱體正中央上方配備一個白熾燈。將單只大鼠從固定的一角面壁放入箱內，由兩名觀察者同時觀察并記錄大鼠在5 min內中央?yún)^(qū)所待的累計時間以及在中央?yún)^(qū)累計站立次數(shù)，評價大鼠的焦慮樣行為[15]。

2.3.2 社會交往實驗 社會交往場實驗裝置(長90 cm，寬90 cm，高50 cm)，房間燈光設置為昏暗。每只大鼠前2天適應環(huán)境，第3天測試開始前，按性別分別將大鼠與另一陌生的伙伴隨機配對。每對互不熟悉的大鼠被同時放入該實驗裝置內，連續(xù)5 min記錄該測試大鼠在主動社會交往行為中所花費的總時間。

2.3.3 多功能閉合式迷宮實驗 多功能閉合式迷宮(Multi-function closed maze,MCM)由直徑200 cm、高80 cm的圓柱體和一個同等直徑的圓形底盤組成。圓柱體被6個扇臂分為6個扇區(qū)，每個扇臂下方分別等間距分布1～4號4個門洞(高9 cm，寬11 cm，洞間距為10 cm)，正上方安裝有攝像裝置記錄數(shù)據(jù)[16-17]。

實驗設計如圖2，路徑設計為A4-B1-C4-D1-E4(A4表示A臂的4號門)，F(xiàn)臂所有門均為關閉狀態(tài)。實驗時將大鼠面壁放入底盤，每只大鼠在迷宮內自由探索10 min；軟件定義起始扇區(qū)的中央?yún)^(qū)并分析大鼠在該中央?yún)^(qū)累計停留時間、探索頻率，分析大鼠類焦慮樣行為。Noldus EthoVision11.5X軟件記錄數(shù)據(jù)。

圖2 MCM路徑起始扇區(qū)的中央?yún)^(qū)

2.3.4 取材 給藥1 h后按照30 mg/kg的劑量對大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉后冰上取腦。

2.3.5 Western blot檢測nNOS、PSD-95表達 海馬組織經蛋白裂解液處理，取上清液，BSA法測定蛋白濃度。選用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜及封閉后加入nNOS (1∶500)、PSD-95 (1∶500)、β-actin (1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h。加入ECL超敏發(fā)光液顯色，以β-actin作為內參，用ImageJ圖像分析軟件進行分析。

3 結果

3.1 曠場實驗結果 由圖3A可見，與對照組相比，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組大鼠在曠場中央?yún)^(qū)探索累計時間顯著減少(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，7-NI 25 mg和7-NI 50 mg組探索累計時間顯著增加(P<0.05)。

3.2 社會交往實驗結果 由圖3B可見，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組大鼠社交攻擊性顯著增加(P<0.001)，與模型組相比，7-NI 25 mg和7-NI 50 mg組大鼠社交攻擊性顯著減少(P<0.001)。

3.3 多功能閉合式迷宮實驗測試結果 由圖4可見，與對照組相比，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組大鼠在MCM中起始扇區(qū)自定義的曠場中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)顯著減少(P<0.05)、訪問累計時間顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，7-NI 25 mg組和7-NI 50 mg組曠場中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)顯著增加(P<0.05)、訪問累計時間顯著增加(P<0.05)。

圖3 曠場實驗、社交實驗結果

圖4 多功能閉合式迷宮實驗測試結果

3.4 Western blot結果 由圖5可見，與對照組相比，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組的PSD-95(P<0.01)及nNOS(P<0.05，P<0.01)表達均明顯升高，與模型組相比，7-NI 25 mg組、7-NI 50 mg組大鼠海馬區(qū)PSD-95(P<0.05)及nNOS蛋白(P<0.01，P<0.001)明顯表達減少。

圖5 Western blot結果

4 討論

在兒童社會-情感成長理論中，父母教養(yǎng)行為被認為是兒童社會、情感、行為和認知發(fā)展的關鍵因素[18]。嚙齒動物MS被普遍用來研究生命早期應激對個體發(fā)育過程中身心健康及學習記憶能力的影響[19]。斷奶后實驗動物的社會隔離會誘發(fā)許多行為和神經化學異常，例如抑郁和焦慮。因此，母嬰分離和社會隔離動物模型適合研究神經精神癥狀的病理生理、探索治療神經精神疾病的潛在藥物[20]。

nNOS廣泛表達于神經元，當機體面對壓力時，nNOS與PSD-95結合形成nNOS-PSD-95復合蛋白。PSD-95是一種介導谷氨酸能突觸可塑性、調解突觸穩(wěn)定性和樹突棘發(fā)生的突觸蛋白，參與調控多種神經精神類疾病，介導興奮性毒性[21]。PSD-95與NMDAR相結合形成NAMDA-PSD-95-nNOS通路，研究表明，該通路功能障礙與多種神經精神疾病有關[22]。MK801是選擇性最強的非競爭性NMDAR阻滯劑之一[23]，可作為一種開放通道的阻滯劑，作用于NMDA受體操縱的離子通道。本研究結果表明，MS合并社會隔離導致青春期大鼠在曠場中央?yún)^(qū)訪問時間減少，并增加了社交攻擊性，其在多功能閉合式迷宮中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)和訪問累計時間均減少，7-NI治療增加了曠場中央?yún)^(qū)訪問累計時間，顯著降低了社交攻擊性，增加了大鼠在迷宮中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)和訪問累計時間，表明25 mg/kg 和50 mg/kg的7-NI均可改善青春期大鼠焦慮樣行為，行為改變沒有隨著劑量增加而改變，這與已有報道一致：重復給予7-NI 大鼠不會導致腦 NOS 的累積抑制[24]。Western blot結果顯示，模型組的PSD-95、nNOS表達較對照組增多，經過7-NI治療降低了模型組nNOS蛋白和PSD-95蛋白的表達，表明大鼠先后經歷了母嬰分離合并社會隔離后大腦神經產生興奮性毒性損傷，而7-NI可以通過降低神經興奮性中毒改善焦慮樣行為。同時，為了研究7-NI對神經突觸的影響是否具有NMDAR依賴性，在MK-801+7-NI處理組中，用MK801預處理后再給予7-NI(25 mg/kg)沒有改善焦慮樣行為，這表明7-NI治療焦慮樣行為作用是依賴NMDAR的。

綜上所述，7-NI改善了青春期大鼠焦慮樣行為，該治療作用可能與PSD-95/nNOS耦聯(lián)降低神經興奮性中毒有關。