基于UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的茵梔黃顆粒主要成分及作用機(jī)制研究Δ

范嘯天，黃志鴻，伍 超，陸 珊，譚影影，巫志姍，吳嘉瑞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院臨床中藥系，北京102488)

從中醫(yī)理論的角度分析，清熱解毒、利濕退黃是茵梔黃顆粒的功效，該藥在治療肝膽濕熱性黃疸中有大量應(yīng)用，患者的臨床表現(xiàn)為面目悉黃、胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃而赤。茵梔黃顆粒在臨床上的使用效果顯著，被《中華人民共和國藥典:一部》(2020年版)[1]收錄，作為急慢性肝炎的推薦用藥。隨著茵梔黃顆粒在肝病治療中的應(yīng)用逐漸增多，對(duì)其質(zhì)量控制的要求也越來越嚴(yán)格。然而，目前對(duì)于茵梔黃顆粒的研究?jī)H限于單一或多種成分的定性分析和含量測(cè)定，物質(zhì)基礎(chǔ)研究薄弱，也尚不清楚藥效學(xué)及作用機(jī)制，阻礙了茵梔黃顆粒進(jìn)一步的臨床使用[2]。因此，本研究利用超高效液相色譜-線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS)技術(shù)，對(duì)比已知數(shù)據(jù)庫中68個(gè)化合物成分，最終確定出茵梔黃顆粒中存在的14個(gè)化合物成分。該方法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速采集母、子離子的高分辨數(shù)據(jù)，特點(diǎn)是可以完整獲得多級(jí)質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合了超高效液相色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度和能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)。本研究通過對(duì)茵梔黃顆粒中化學(xué)成分的主要檢測(cè)指標(biāo)的定性分析，建立了茵梔黃顆粒中化學(xué)成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)模型，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和技術(shù)，篩選出主要化學(xué)成分和重要靶點(diǎn)，通過可視化分析，探討了茵梔黃顆粒的成分、基因靶點(diǎn)和途徑之間的關(guān)系，并預(yù)測(cè)其潛在作用機(jī)制，對(duì)茵梔黃顆粒的臨床使用和質(zhì)量控制等提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜儀(美國Thermo Scientific公司)；LTQ-Orbitrap XL型質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源及Xcalibur2.1化學(xué)工作站，美國Thermo Scientific公司)；MTW120型萬分之一電子天平(深圳東美測(cè)量?jī)x器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

新綠原酸(CAS編號(hào)為906-33-2，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，綠原酸(CAS編號(hào)為327-97-9，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，梔子苷(CAS編號(hào)為24512-63-8，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，1,3-二咖啡酰奎寧酸(CAS編號(hào)為30964-13-7，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，木犀草苷(CAS編號(hào)為1268798，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，3,4-二咖啡?？鼘幩?異綠原酸B)(CAS編號(hào)為14534-61-3，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，3,5-二咖啡?；鼘幩?異綠原酸A，CAS編號(hào)為89919-62-0，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，4,5-二咖啡?？鼘幩?異綠原酸C)(CAS編號(hào)為57378-72-0，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，黃芩苷(CAS編號(hào)為21967-41-9，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，濱蒿內(nèi)酯(CAS編號(hào)為120-08-1，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，漢黃芩素(CAS編號(hào)為632-85-9，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，黃芩素(CAS編號(hào)為491-67-8，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，漢黃芩苷(CAS編號(hào)為51059-44-0，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，千層紙素A(CAS編號(hào)為480-11-5，規(guī)格為20 mg，HPLC≥98%)，均購自四川樂美天有限公司。甲醇、甲酸和乙腈(質(zhì)譜級(jí))購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；水是屈臣氏瓶裝蒸餾水；其他試劑均選取分析純。

2 方法

2.1 茵梔黃顆粒定性檢定樣品制備

精密稱量茵梔黃顆粒2.000 g溶于10倍量70%甲醇溶液中，超聲提取30 min，6 000 r/min離心(離心半徑4.9 cm，時(shí)間5 min)，然后使用移液器吸取上清液，采用注射器裝0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，冷藏儲(chǔ)存待用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

使用精密天平稱取各化合物對(duì)照品1.0 mg，使用移液器移取甲醇配制為1.0 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。通過用上述各項(xiàng)單一對(duì)照品溶液精密量取后用甲醇稀釋為儲(chǔ)備液，制備出質(zhì)量濃度為10 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為ACQUITY PRM UPLC BEH C18Column with Van Guard FIT色譜柱(美國 Waters公司，2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱溫30 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)[梯度洗脫方法：0～5 min，1%B；5～14 min，1%～15%B；14～38 min，15%～35%B；38～55 min，35%～55%B；55～60 min，55%～95%B；60～66 min，95%B]；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣體積2 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式下：電離源電壓-3.0 kV，毛細(xì)管電壓-35 V，管透鏡電壓-110 V；正離子模式下：電離源電壓4 KV，毛細(xì)管電壓35 V，管透鏡電壓110 V；離子源溫度350 ℃，碰撞電壓6～10 V；干燥氣流速15 L/min；鞘氣流速為40 L/min，輔助氣流速為20 L/min；數(shù)據(jù)采用傅里葉變換高分辨全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z:50～1 200，檢測(cè)分辨率3 000。使用高純氮?dú)鉃榍蕷夂洼o助氣(純度>99.99%)。質(zhì)譜多級(jí)碎片離子檢測(cè)采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取相應(yīng)度前3的離子進(jìn)行多級(jí)碎裂，碎裂方式為CID碰撞誘導(dǎo)裂解，歸一化裂解能量為35%。洗針液為甲醇；柱溫箱溫度為30 ℃。

2.5 數(shù)據(jù)采集和分析

原始數(shù)據(jù)通過Xcalibur 2.1分析軟件進(jìn)行處理，通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分子離子峰提取與相關(guān)峰對(duì)齊，得到對(duì)應(yīng)分子的離子峰。然后，利用軟件內(nèi)自帶程序得到化合物的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布。測(cè)量到的二級(jí)質(zhì)譜片段與mz Cloud數(shù)據(jù)庫和從文獻(xiàn)中自建的本地中藥成分?jǐn)?shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配。保留質(zhì)量偏差<5 ppm的可識(shí)別化學(xué)成分。最后，利用離子碎片信息、精確的相對(duì)分子質(zhì)量和比較推斷對(duì)化合物進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.6 成分靶點(diǎn)搜集

本實(shí)驗(yàn)對(duì)14個(gè)中藥化合物成分的靶標(biāo)基于Swiss Target Prediction和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測(cè)。TCMSP數(shù)據(jù)庫所使用的預(yù)測(cè)方法是基于藥物-蛋白關(guān)系對(duì)的相似性來預(yù)測(cè)中藥組成化合物的潛在靶標(biāo)。選取其中度值>20的蛋白作為本研究的潛在靶點(diǎn)。Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫是基于小分子和配體約束的立體圖像相似性度量值進(jìn)行預(yù)測(cè)，為實(shí)際目標(biāo)選擇的真實(shí)目標(biāo)估計(jì)概率P值≥0.1的潛在靶標(biāo)。

2.7 黃疸疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“icterus”和“jaundice”為關(guān)鍵詞，在人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫、治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫為關(guān)鍵詞進(jìn)行黃疸相關(guān)疾病靶點(diǎn)篩選。合并獲得的相關(guān)靶點(diǎn)，去重后得到相應(yīng)的疾病靶點(diǎn)。

2.8 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

成分靶點(diǎn)在Uniprot網(wǎng)站進(jìn)行g(shù)ene symbol轉(zhuǎn)換，將得到的靶基因與黃疸相關(guān)靶基因整合后遞交R軟件中程序包計(jì)算，篩得二者交集靶基因作為茵梔黃顆粒治療黃疸的潛在靶基因；將交集靶基因輸入String數(shù)據(jù)庫以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，其物種被限定為“homo sanpiens”，篩選得到PPI關(guān)系，下轉(zhuǎn)tsv格式文件后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，生成PPI網(wǎng)絡(luò)圖，使用cytohubba插件篩選后選出核心靶點(diǎn)。

2.9 核心靶點(diǎn)基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

利用Cluster Profiler數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，選擇“homo sapiens”，設(shè)置P(value)為0.01，進(jìn)行了分子功能(MF)、生物過程(BP)和細(xì)胞組成(CC)3項(xiàng)分析。同時(shí)，根據(jù)蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，選取關(guān)鍵通路，模擬構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2.10 分子對(duì)接驗(yàn)證

依據(jù)茵梔黃顆粒治療黃疸的2條通路中靶點(diǎn)的度值，選取各通路排序靠前的關(guān)鍵靶點(diǎn)。隨后從PDB數(shù)據(jù)庫中下載活性成分的SDF格式文件，再通過AutoDock Vina軟件，準(zhǔn)備藥物小分子對(duì)接的配體和蛋白質(zhì)，預(yù)處理蛋白質(zhì)、去除水分子、加氫原子和調(diào)整對(duì)接立場(chǎng)口袋大小。隨后將2條通路中的靶蛋白依據(jù)度值大小進(jìn)行關(guān)聯(lián)性排序，選取度值高的前5個(gè)關(guān)鍵靶蛋白分別與綠原酸和濱蒿內(nèi)酯做分子對(duì)接。最后，使用圖像查看軟件Pymol查看對(duì)接結(jié)果，并且截圖標(biāo)識(shí)對(duì)接位置。

3 結(jié)果

3.1 茵梔黃顆粒成分定性鑒別分析

線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜(LTQ-Orbitrap MS)具有分離效率高、掃描速度快、分辨率高和靈敏度高的特點(diǎn)，提供精確相對(duì)分子質(zhì)量和MSn多級(jí)質(zhì)譜信息對(duì)一個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行更全面的描述。接下來通過離子碎片對(duì)比、精確相對(duì)分子質(zhì)量參考、對(duì)照品比對(duì)以及綜合文獻(xiàn)分析可以確定出14個(gè)化合物[3-14]。比較正負(fù)離子流圖清晰程度，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子結(jié)果較優(yōu)質(zhì)，在圖中用數(shù)字表示出14個(gè)化合物分子離子峰所出現(xiàn)的時(shí)間。其中，1為濱蒿內(nèi)酯，2為黃芩素，3為漢黃芩素，4為千層紙素 A，5為新綠原酸，6為綠原酸，7為梔子苷，8為黃芩苷，9為漢黃芩苷，10為異綠原酸A，11為木樨草甘，12為異綠原酸B，13為1,3咖啡?？鼘幩?，14為異綠原酸C，見圖1—2。

圖1 負(fù)離子模式下茵梔黃顆粒樣品UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS的總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS of Yinzhihuang granule sample under negative ion mode

圖2 負(fù)離子模式下混合標(biāo)準(zhǔn)品UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS的總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram of UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS of mixed sample under negative ion mode

3.2 茵梔黃顆?；衔锖忘S疸相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)以及數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，可以明確獲知茵梔黃顆粒中的14個(gè)化合物成分，將其導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫和Swiss TargetPrediction數(shù)據(jù)庫中，獲得188個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得黃疸的疾病靶點(diǎn)3 365個(gè)，靶點(diǎn)的Relevance score最大值為9.41，最小值為0.19，與多個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果合并，去除重復(fù)值，最終得到3 365個(gè)黃疸疾病靶點(diǎn)。

3.3 成分-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將最終所獲得的基因靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)基因輸入Excel軟件取交集，獲得137個(gè)交集靶點(diǎn)。將基因中交集的部分導(dǎo)入String 11.0平臺(tái)，構(gòu)建茵梔黃顆粒靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)，其基于PPI作用，剔除游離節(jié)點(diǎn)，選擇medium confidence數(shù)值為0.04處理后，下載tsv格式文件后采用Cytoscape 3.7.2軟件打開。利用Cytohubba插件篩選得到核心靶點(diǎn)31個(gè)，說明這31個(gè)可能是潛在治療靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 治療靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network diagram of PPI of treatment target

3.4 核心靶點(diǎn)的功能與通路的分析

利用R軟件中代碼調(diào)取ClusterProfiler數(shù)據(jù)庫資源對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析(P<0.01)，選取度值與可信度綜合排序居前20位的GO條目繪制氣泡圖，見圖4。由此發(fā)現(xiàn)，BP在細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)(cellular response to drug)、不飽和脂肪酸代謝過程(unsaturated fatty acid metabolic process)、激素代謝過程(hormone metabolic process)和對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)(response to oxidative stress)等方面靶點(diǎn)富集較集中；MF靶點(diǎn)主要富集在類固醇羥化酶活性(steroid hydroxylase activity)、RNA轉(zhuǎn)錄因子活性(RNA polymerase Ⅱ-specific)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)和代謝過程(protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)；作用靶點(diǎn)在CC中主要富集條目為膜筏( membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、突觸(glutamatergic synapse)和神經(jīng)元胞體(neuronal cell body)等。

圖4 GO條目氣泡圖Fig 4 Bubble chart of GO entry

KEGG通路富集分析中，篩選得到度值與可信度綜合排序居前20位(P<0.01)的信號(hào)通路繪制生成氣泡圖，見圖5。由此可知，疾病方面為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)、乙型肝炎(hepatitis B)；生物通路方面涉及類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號(hào)通路、PD-L1表達(dá)和 PD-1表達(dá)從而影響的癌癥通路(PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer)、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路和白細(xì)胞介素(IL)17信號(hào)通路等。

圖5 KEGG條目氣泡圖Fig 5 Bubble chart of KEGG entry

圖4—5中，橫軸表示為靶基因所占百分比，縱軸表示為通路名稱，通路富集基因數(shù)量為氣泡面積，-Log(P-value)值的大小表現(xiàn)為氣泡顏色的不同，其值越大氣泡顏色相應(yīng)變深。

3.5 成分-核心靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

根據(jù)蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的相互關(guān)系，以P<0.01為條件篩選出關(guān)鍵通路2條，未發(fā)現(xiàn)靶基因不在相關(guān)通路的情況，新綠原酸、綠原酸、梔子苷、1,3-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、異綠原酸B(3,4-二-O-咖啡酰奎寧酸)、3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(異綠原酸A)、4,5-二-O-咖啡酰奎寧酸(異綠原酸C)、濱蒿內(nèi)酯、漢黃芩素、黃芩素、漢黃芩苷和千層紙素A，以上14個(gè)是得到的化學(xué)成分。然后構(gòu)建“成分-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。其中，圓角矩形為藥物，菱形與倒V字形為通路，八邊形為化合物，圓形、三角形、六邊形和斜四邊形為疾病靶點(diǎn)；最內(nèi)環(huán)的三角形為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)通路的靶點(diǎn)，六邊形為類固醇激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)通路的靶點(diǎn)，斜四邊形為上述2個(gè)通路的共有靶點(diǎn)。

3.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

將31個(gè)目的蛋白通過度值大小排序，篩選出前5位的靶點(diǎn)蛋白，即絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)1、MAPK3、腫瘤蛋白p53(TP53)、CYP2C9和CASP3。通過AutoDock Vina軟件將目的蛋白分別與綠原酸、濱蒿內(nèi)酯進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果顯示，MAPK1、MAPK3、TP53、CYP2C9和CASP3分別與綠原酸、濱蒿內(nèi)酯的最低結(jié)合能均<-21.0 kJ/mol，見表1；并制成分子對(duì)接圖，見圖7。

表1 分子對(duì)接重要靶點(diǎn)結(jié)合能表(kJ/mol)Tab 1 Binding energy table of important targets for molecular docking (kJ/mol)

4 討論

4.1 定性方法的優(yōu)化

在茵梔黃顆粒的定性鑒別實(shí)驗(yàn)中，為了盡可能多地鑒定茵梔黃顆粒的成分，本研究采用了高劑量富集的方式。同時(shí)，在進(jìn)樣過程中，使用了預(yù)柱進(jìn)行處理，極大減小了背景噪聲的影響，并優(yōu)化了峰形，使得分離更加完整，獲得更加均勻一致的離子碎片。本研究中14種化合物的離子碎片信息因此而確定。

4.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

中醫(yī)認(rèn)為，黃疸主要由濕熱感冒、血瘀脾虛引起，辨證分型以濕熱蘊(yùn)結(jié)為主，治以利濕利小便，治法以清熱利濕、溫中補(bǔ)虛和化瘀散結(jié)等為主。茵梔黃顆粒的藥物組成為茵陳、黃芩、梔子和金銀花4位中藥，重用君藥茵陳，因其善能清熱利濕退黃，為治黃疸之主藥；梔子為臣藥，可清熱降火、通利三焦，助茵陳引濕熱從小便而去；黃芩瀉熱逐瘀，導(dǎo)瘀熱而下，為佐藥；使以金銀花，幫助其他3藥，以利濕與泄熱相伍，使二便通利，前后分消，濕熱得行，瘀熱得下，則黃疸自退[15-16]。

A.綠原酸與MAPK1對(duì)接圖；B.濱蒿內(nèi)酯與MAPK1對(duì)接圖；C.綠原酸與MAPK3對(duì)接圖；D.濱蒿內(nèi)酯與MAPK3對(duì)接圖；E.綠原酸與TP53對(duì)接圖；F.濱蒿內(nèi)酯與TP53對(duì)接圖；G.綠原酸與CYP2C9對(duì)接圖；H.濱蒿內(nèi)酯與CYP2C9對(duì)接圖；I.綠原酸與CASP3對(duì)接圖；J.濱蒿內(nèi)酯與CASP3對(duì)接圖A.Docking diagram of chlorogenic acid and MAPK1; B.Docking diagram of scoparone and MAPK1; C.Docking diagram of chlorogenic acid and MAPK3; D.Docking diagram of scoparone and MAPK3; E.Docking diagram of chlorogenic acid and TP53; F.Docking diagram of scoparone and TP53; G.Docking diagram of chlorogenic acid and CYP2C9; H.Docking diagram of scoparone and CYP2C9; I.Docking diagram of chlorogenic acid and CASP3; J.Docking diagram of scoparone and CASP3圖7 茵梔黃顆?；钚猿煞?黃疸疾病核心蛋白對(duì)接模式Fig 7 Docking mode of active ingredient of Yinzhihuang granules-disease core protein of jaundice

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出茵梔黃顆粒中的25種有效化學(xué)成分，并通過液質(zhì)聯(lián)用分析方法共收集到14種有效化學(xué)成分和188種相應(yīng)靶點(diǎn)，并分析上述有效成分及靶點(diǎn)。綠原酸是最活躍的物質(zhì)，其作用靶點(diǎn)最多，也是茵陳、梔子和金銀花共有的化學(xué)成分。研究結(jié)果表明，綠原酸為黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、減輕肝毒性和預(yù)防肝纖維化等多重生物活性作用[17]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，濱蒿內(nèi)酯具有影響CYP2C9從而反饋致使CYP450酶活性降低的作用，而活性低下的CYP450酶可能是導(dǎo)致黃疸疾病發(fā)生和發(fā)展的重要原因，濱蒿內(nèi)酯作為退黃藥物，其利膽退黃的作用基礎(chǔ)可能是降低CYP2C9誘導(dǎo)活性的作用[18]。

通過藥物和疾病交叉獲得137個(gè)交集靶點(diǎn)指標(biāo)。關(guān)鍵的靶點(diǎn)蛋白包括蛋白激酶1(AKT1)、TP53、IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、CASP3、TNF和MAPK8。AKT1參與多種通路，包括PI3K和EGFR，并通過炎癥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和纖維形成，在肝損傷中發(fā)揮獨(dú)特作用[19]。IL-6能激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，是一種多功能細(xì)胞因子，在影響肝細(xì)胞凋亡、抗炎和抗氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用[20]。VEGFA作為高內(nèi)皮特異性有絲分裂原，其在血管和血管生成中起重要調(diào)控作用。VEGF在表達(dá)時(shí)，能夠促進(jìn)血管形成，在肝臟再生和肝損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[21-22]。通過對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，預(yù)測(cè)茵梔黃顆粒治療黃疸可能涉及DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信號(hào)受體激活劑活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶和氧化還原酶活性等生物過程。經(jīng)由基礎(chǔ)的KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)茵梔黃顆?？梢酝ㄟ^脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路、類固醇激素生物合成通路對(duì)黃疸進(jìn)行治療。生物體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一為MAPK，其參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程[23]。PI3K/Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究結(jié)果證明，PI3K/Akt通路激活具有抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡，保護(hù)肝臟的作用[24-25]。HIF-1為低氧濃度或缺氧應(yīng)答的一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過激活參與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和能量代謝的下游靶基因而影響肝細(xì)胞[26]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)茵梔黃顆粒治療黃疸的活性成分、靶點(diǎn)和通路進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，論證了茵梔黃顆粒多成分、多靶點(diǎn)和多途徑特性，對(duì)茵梔黃顆粒治療黃疸的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并通過分子對(duì)接技術(shù)證實(shí)茵梔黃顆粒中的多種活性成分可作用于MAPK1、MAPK3、CYP450和CASP3蛋白。由上述論據(jù)推斷，茵梔黃顆粒通過改良脂質(zhì)變化來治療黃疸。本研究綜合使用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液質(zhì)聯(lián)用成分分析方法與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，鑒定出茵梔黃顆粒成分以及預(yù)測(cè)茵梔黃顆粒治療黃疸的潛在作用機(jī)制，上述結(jié)論及具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究論證。