廣西壯族女性人群中ST K11基因遺傳多態(tài)性的研究

凌永嫦，仇雯麗，王俊利，吳惠珍

1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院產(chǎn)科，廣西 百色 533000；

2.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000

STK11 又被稱為肝激酶B1(LKB1)，該基因是腫瘤抑制因子，位于人類染色體19p13.3 上，其細(xì)胞功能可通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)，還可通過(guò)磷酸化和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)及其相關(guān)激酶的激活影響癌細(xì)胞的極性、代謝和增殖[1]。各種癌癥可通過(guò)基因突變或表觀遺傳失活來(lái)抑制該基因的功能從而促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[2]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，有關(guān)STK11 基因的研究主要是以基因表達(dá)水平和mRNA為主，其中基因表達(dá)水平以遺傳多態(tài)性多見(jiàn)，有文獻(xiàn)報(bào)道STK11基因遺傳多態(tài)性與結(jié)直腸癌[3]、糖尿病[4]和帕金森[5]等疾病相關(guān)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)STK11 基因遺傳多態(tài)性與疾病之間存在區(qū)域差異性。目前未發(fā)現(xiàn)單純的STK11 基因遺傳多態(tài)性分布的有關(guān)文獻(xiàn)。因此，本文采用imLDR技術(shù)檢測(cè)了廣西壯族正常女性人群STK11 基因rs12977689、rs60755851和rs9282860的基因型，并與千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)中不同國(guó)家或地區(qū)正常女性人群的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，分析STK11基因型和等位基因在不同女性人群中的分布差異，為STK11基因遺傳多態(tài)性和疾病易感性的研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2018—2020 年在廣西右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院健康體檢中心進(jìn)行健康體檢的壯族正常女性共351 例，年齡(51.57±8.86)歲，所研究人群各項(xiàng)臨床檢查和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均正常，且為長(zhǎng)期居住在廣西地區(qū)，無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)惡性腫瘤、精神病、慢性病和自身免疫性疾病等。本研究經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 樣本DNA的提取 采集研究對(duì)象的空腹靜脈血5 mL 于肝素抗凝管，使用深圳亞能公司DNA 提取試劑盒提取外周血DNA，放置-80℃冰箱備用。

1.3 引物合成和基因型檢測(cè) STK11基rs12977-689、rs60755851 和rs9282860 位點(diǎn)委托上海天昊生物科技有限公司采用在線Primer3 軟件設(shè)計(jì)合成引物(表1)。采用HotStarTaq(Qiagen 公司)對(duì)研究樣本DNA進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，PCR 反應(yīng)體系(20 μL)：1×GC-I buffer (Ta-KaRa 公司)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U HotStarTaqpolymerase(Qiagen 公司)，1 μL 樣本DNA和1 μL 多重PCR 引物。PCR 循環(huán)：95℃2 min；11 個(gè)循壞(94℃20 s，65℃40 s，72℃1.5 min)；24 個(gè)循壞(94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min)；72℃2 min。多重PCR 產(chǎn)物純化：在20 μL PCR 產(chǎn)物中加入5 U SAP 酶和2 U Exonuclease I酶，37℃溫浴60 min，然后75℃滅活15 min 進(jìn)行多重PCR 產(chǎn)物純化。連接反應(yīng)體系：10×連接緩沖液1 μL、高溫連接酶0.25 μL、5′連接引物混合液(1 μmol/L)0.4 μL，3′連接引物混合液(2 μmol/L)0.4μL、純化后多重PCR 產(chǎn)物2 μL、ddH2O 6 μL 混勻。連接程序：38個(gè)循壞(94℃1 min，56°C 4 min)。接著取1 μL 稀釋后的連接產(chǎn)物，與0.1 μL Liz500 size standard、9 μ L Hi-Di 混 勻，95℃變 性5 min 后 上ABI3730XL 測(cè)序儀，通過(guò)毛細(xì)管電泳鑒別連接產(chǎn)物。用GeneMapper4.1 (Applied Biosystems，USA)軟件進(jìn)行SNP 基因型分型，最后用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證。該試驗(yàn)委托上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行。

表1 rs12977689、rs60755851和rs9282860位點(diǎn)的引物信息

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)算基因型和等位基因頻率，計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示。采用孟德?tīng)栠z傳平衡定律驗(yàn)證研究對(duì)象是否具有代表性。使用SPSS24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，兩組間基因型和等位基因分布差異比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STK11基因rs12977689、rs60755851和rs928-2860 基因型的分型情況 三個(gè)位點(diǎn)的基因型均符合孟德?tīng)栠z傳平衡定律(P=0.373，P=0.199，P=0.344)，說(shuō)明研究對(duì)象具有代表性。結(jié)果顯示，rs12977689 和rs60755851 的基因型是CC、CA、AA，rs9282860 的基因型是CC、CT、TT。Sanger 測(cè)序法驗(yàn)證基因型結(jié)果，三個(gè)位點(diǎn)的測(cè)序圖見(jiàn)圖1。

圖1 rs12977689、rs60755851 和rs9282860測(cè)序圖

2.2 STK11 基 因rs12977689、rs60755851 和rs9282860 位點(diǎn)多態(tài)性的分布情況 rs12977689 基因型CC、CA、AA 的頻率分別為51.0%、44.2%、6.8%，等位基因C、A 頻率分別為72.1%、27.9%，rs60755851 基因型AA、CA、CC頻率分別為37.3%、50.2%、12.5%，等位基因A、C 頻率分別為62.4%、37.6%。rs9282860 基因型CC、CT、TT 頻率分別為70.9%、27.4%、1.7%，等位基因C、T 頻率分別為84.6%、15.4%，見(jiàn)表2。rs12977689、rs60755851 和rs9282860 多態(tài)性位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)，表明所選群體符合孟德?tīng)栠z傳平衡定律(P=0.373，P=0.199和P=0.344)，見(jiàn)表2。

表2 廣西壯族正常女性人群rs12977689、rs60755851、rs9282860的分布[例(%)]

2.3 STK11基因rs12977689、rs60755851和rs928-2860 位點(diǎn)多態(tài)性與不同人群比較 廣西壯族正常女性人群rs12977689和rs60755851的基因型和等位基因分布頻率與非洲、美國(guó)、歐洲、南亞以及印度的正常女性比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與日本的正常女性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3、表4。廣西壯族正常女性rs60755851 位點(diǎn)的基因型與北京漢族正常女性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。廣西壯族正常女性rs9282860 的基因型和等位基因頻率與非洲、日本和歐洲的正常女性比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表5。

表3 rs12977689在不同女性人群的分布頻率[例(%)]

表4 rs60755851在不同女性人群的分布頻率[例(%)]

表5 rs9282860在不同女性人群的分布頻率[例(%)]

3 討論

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因組中的單個(gè)核苷酸在成對(duì)染色體中不同時(shí)發(fā)生的DNA序列變異，它代表了人類基因組中最常見(jiàn)且重要的變異類型。這些簡(jiǎn)單的變化可以是轉(zhuǎn)換或顛換類型，它們以大約千分之一的頻率發(fā)生在整個(gè)基因組中。編碼區(qū)的某些SNP 會(huì)改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列，而編碼區(qū)的其他SNP 不會(huì)影響蛋白質(zhì)序列；非編碼區(qū)的SNP 也可能影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，基因剪接或信使RNA(mRNA)降解?？傊?，編碼區(qū)或非編碼區(qū)的SNP 都可能會(huì)影響啟動(dòng)子活性(基因表達(dá))、mRNA構(gòu)象(穩(wěn)定性)以及mRNA和/或蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位，從而導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生[6]。SNP在種群遺傳學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中都非常重要，近年來(lái)大量研究表明基因多態(tài)性對(duì)疾病易感性起著重要的作用，可作為疾病的病因和發(fā)病危險(xiǎn)因素，也可作為某些疾病的遺傳標(biāo)記。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)有關(guān)STK11基因的研究主要是以基因表達(dá)水平和mRNA為主，其中基因表達(dá)水平以遺傳多態(tài)性多見(jiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，STK11的rs8111699位點(diǎn)的SNP與帕金森病和西班牙婦女的妊娠期糖尿病有關(guān)[5，7]，而ALHARBI 等[8]發(fā)現(xiàn)rs8111699 位點(diǎn)的SNPs 與沙特婦女的妊娠糖尿病無(wú)關(guān)。目前未發(fā)現(xiàn)關(guān)于STK11基因多態(tài)性在廣西壯族人群分布情況的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步分析了STK11基因其他常見(jiàn)SNPs位點(diǎn)在不同國(guó)家或地區(qū)正常女性人群中的分布差異，這將有助于探討不同地區(qū)人群遺傳多態(tài)性與疾病易感性的差異，為疾病的診療和預(yù)后提供臨床思路。

本研究結(jié)果表明，廣西壯族正常女性人群中rs12977689和rs60755851位點(diǎn)存在CC、CA和AA 三種基因型；而rs9282860 存在TT、TC 和CC 三種基因型。這三個(gè)位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。廣西壯族正常女性人群的rs12977689和rs60755851的基因型和等位基因分布頻率與非洲、美國(guó)、歐洲、南亞和印度的正常女性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與日本的正常女性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；廣西壯族正常女性rs60755851位點(diǎn)的基因型與北京漢族正常女性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；廣西壯族正常女性rs9282860 基因型和等位基因分布頻率與非洲、日本和歐洲地區(qū)的正常女性人群比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因：首先，廣西與非洲、美國(guó)、歐洲、南亞、印度等地區(qū)由于種族文化、地域差異、居住環(huán)境、遺傳背景、生活習(xí)慣等多種因素影響，且無(wú)親緣關(guān)系，故遺傳多態(tài)性差異也大。其次，日本與中國(guó)相鄰，地域差異相對(duì)小，故基因遺傳多態(tài)性差異不明顯。因此，廣西壯族正常女性rs12977689和rs60755851位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性與日本正常女性比較無(wú)差異或差異相對(duì)??；但在rs9282860 位點(diǎn)卻有差異，這可能與遺傳背景、居住環(huán)境和種族不同有關(guān)。除此之外，廣西壯族和北京漢族屬于同一種族，按親緣關(guān)系，遺傳多態(tài)性本應(yīng)無(wú)差異，但在rs60755851 位點(diǎn)卻存在差異性，考慮可能是壯族和漢族人群遺傳背景不同，也可能是少數(shù)民族居住地的環(huán)境、生活習(xí)慣不同所致。有研究表明，中國(guó)漢族2型糖尿病患者中STK11 基因rs12977689 等位基因A攜帶者的冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非攜帶者[9]。BOULLERNE 等[10]研究發(fā)現(xiàn)rs9282860 位點(diǎn)的SNP 在多發(fā)性硬化癥的女性患者中頻率增加；接著還發(fā)現(xiàn)rs9282860 位點(diǎn)的SNP 在非裔美國(guó)人繼發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥患者中患病率最高，并且在該隊(duì)列中，SNP與出現(xiàn)癥狀和診斷時(shí)的年齡較大有關(guān)，可影響早期發(fā)病和病情進(jìn)展，是該人群中繼發(fā)性進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥的一個(gè)危險(xiǎn)因素[11]。目前關(guān)于這三個(gè)位點(diǎn)與疾病易感性研究的文獻(xiàn)相對(duì)少，但以上的研究結(jié)果表明，STK11 基因遺傳多態(tài)性與疾病易感性存在差異，為今后研究STK11 基因多態(tài)性與不同國(guó)家或地區(qū)人群疾病易感性的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)廣西壯族正常女性人群與其他國(guó)家或地區(qū)正常女性人群中rs12977689、rs60755851和rs9282860 位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性存在差異，由此可推測(cè)不同國(guó)家或地區(qū)由于遺傳背景、種族文化和居住環(huán)境不同，對(duì)疾病易感性也有所差異。但本研究仍存在一定的局限性：(1)納入的病例數(shù)量少，且未能剔除環(huán)境因素的影響；(2)本研究對(duì)象為本地區(qū)壯族女性，無(wú)法完整反映真實(shí)情況，因此對(duì)基因多態(tài)性的研究需擴(kuò)大研究對(duì)象來(lái)源和選擇更多SNP位點(diǎn)。