利多卡因通過(guò)miR-146b-5p調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的分子機(jī)制研究

呂艷玲，王冰

寶雞市人民醫(yī)院麻醉科，陜西 寶雞 721000

利多卡因是臨床常用的局部酰胺類(lèi)麻醉劑，對(duì)急性或慢性疼痛疾病，如神經(jīng)性疼痛、炎癥和傷害性疼痛具有突出的療效[1]。除此之外，利多卡因還具有顯著的抗癌活性[2]。研究表明，利多卡因可以抑制胃癌[3]、肺癌[4]、膀胱癌[5]和卵巢癌[6]等癌癥的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。利多卡因是一種有效的腫瘤抑制劑，但其對(duì)胃癌作用機(jī)制的研究有限。微小RNA(microRNA，miRNA)不僅是管理細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，并且在調(diào)節(jié)藥物療效和毒性方面也發(fā)揮著重要作用[7]。研究證實(shí)miR-146b-5p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為是胃癌的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[8]。較高水平的miR-146b-5p 能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和減輕凋亡[9]。由于miR-146b-5p 在胃癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，因此深入研究miR-146b-5p 在利多卡因功效中扮演的角色十分必要。本研究旨在探討利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及其作用機(jī)制是否與miR-146b-5p 有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細(xì)胞SNU-1(武漢普諾賽)，利多卡因(≥99.7%，100 mg；中國(guó)食品藥品檢定研究院)，anti-miR-NC、anti-miR-146b-5p、miR-NC、miR-146b-5p(上海Genepharma)，CCK-8 溶液(日本Dojindo)，BCA Protein Assay Kit(美國(guó)Pierce)，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)兔單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Cleaved Caspase-3)兔單克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶2 (matrix metalloprotease，MMP2)兔單克隆抗體、MMP9 兔單克隆抗體(美國(guó)Abcam)，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI) (上海Sangon)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海Toyobo)，SYBR Green實(shí)時(shí)PCR試劑盒(德國(guó)Roche Diagnostics)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SNU-1細(xì)胞在青霉素(100 IU/mL)、含鏈霉素(100 μg/mL)和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱保持濕潤(rùn)、95%空氣、5%CO2的環(huán)境，溫度為37℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為NC組、50 μmol/L利多卡因組、100 μmol/L利多卡因組、200 μmol/L利多卡因組、anti-miR-NC 組、anti-miR-146b-5p 組、miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組和miR-146b-5p+200 μmol/L利多卡因組8 組。其中，NC 組SNU-1 細(xì)胞未經(jīng)任何處理，50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細(xì)胞以50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 利多卡因處理24 h[2]。anti-miR-NC組、anti-miR-146b-5p組、miR-NC+200 μmol/L利多卡因組和miR-146b-5p+200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細(xì)胞分別按照Lipofectamine 2000 試劑操作指南轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-146b-5p、miR-NC、miR-146b-5p，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞或以200 μmol/L利多卡因處理24 h。

1.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 SNU-1 細(xì)胞重新接種到96孔板中(大約5×103個(gè)細(xì)胞/孔)。然后，將10 μL CCK-8 溶液加入到細(xì)胞中。細(xì)胞在由濕潤(rùn)、95%空氣和5%CO2的環(huán)境中孵育1 h 后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A值(450 nm)評(píng)估細(xì)胞增殖。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 SNU-1 細(xì)胞經(jīng)不同處理后，接種到6孔板(大約1×105個(gè)細(xì)胞/孔)，用冷磷酸鹽緩沖液洗滌，然后重懸于結(jié)合緩沖液中，將細(xì)胞在5 μL Annexin V-FITC 和PI 中避光染色15 min。根據(jù)FACS can 流式細(xì)胞儀的說(shuō)明進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。凋亡結(jié)果通過(guò)FlowJo軟件計(jì)算。

1.6 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲 細(xì)胞遷移測(cè)定通過(guò)Transwell 小室進(jìn)行。上層填充有稀釋于無(wú)血清培養(yǎng)基的SNU-1 細(xì)胞。下層補(bǔ)充有血清培養(yǎng)基。37℃孵育后，用甲醇固定細(xì)胞，將SNU-1 細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫染色10 min，計(jì)算遷移到膜下側(cè)的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲測(cè)定與細(xì)胞遷移測(cè)定類(lèi)似，但在細(xì)胞侵襲測(cè)定中，Transwell小室上層預(yù)先涂有基質(zhì)膠。其余步驟與細(xì)胞遷移測(cè)定相同。

1.7 Western blot 檢 測(cè)CyclinD1、Cleaved Caspase-3、MMP2、MMP9 蛋白相對(duì)表達(dá) 通過(guò)使用蛋白提取試劑盒獲得SNU-1 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，采用BCA Protein Assay Kit計(jì)算蛋白濃度。等量的蛋白質(zhì)(30 μg)在100℃下于上樣緩沖液中變性15 min。將含有等量蛋白并在樣品緩沖液中制備的樣品加載到8%～12%SDS/PAGE 孔中，并通過(guò)電壓梯度轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜在5%脫脂牛奶中封閉過(guò)夜，與抗CyclinD1、抗Cleaved Caspase-3、抗MMP2、抗MMP9、抗β-actin(內(nèi)源性對(duì)照)一抗在4℃下輕搖過(guò)夜，與羊抗兔二抗孵育。顯影后通過(guò)Image Lab軟件估計(jì)不同的蛋白條帶。

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)miR-146b-5p 表達(dá) 用TRIzol 試劑從不同處理SNU-1 細(xì)胞中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA 特異性miRNA RT 引物從RNA樣品中產(chǎn)生cDNA。U6 snRNA用作數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)源性對(duì)照。使用SYBR Green實(shí)時(shí)PCR試劑盒在A(yíng)BI Prism 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用2-ΔΔCt方法確定相對(duì)miR-146b-5p 表達(dá)。引物序列(5′-3′)為miR-146b-5p F：GGGCGGTGAGAACTGAATT，miR-146b-5p R：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACA，U6 R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度利多卡因?qū)NU-1 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 不同濃度利多卡因處理SNU-1細(xì)胞后，與NC組比較，50 μmol/L利多卡因組、100 μmol/L利多卡因組、200 μmol/L利多卡因組細(xì)胞的增殖能力逐漸減弱，凋亡率逐漸增加，遷移和侵襲數(shù)量逐漸減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1和圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表1 不同濃度利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響(±s，n=9)

表1 不同濃度利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響(±s，n=9)

注：與NC比較，aP＜0.05。

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2.2 不同濃度利多卡因?qū)NU-1 細(xì)胞中有關(guān)蛋白表達(dá)的影響 不同濃度利多卡因處理SNU-1細(xì)胞后，與NC 組比較，50 μmol/L 利多卡因組、100 μmol/L利多卡因組、200 μmol/L 利多卡因組細(xì)胞的CyclinD1蛋白、MMP2 蛋白和MMP9 蛋白的表達(dá)量逐漸降低，Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)量逐漸增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表2和圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)CyclinD1、Cleaved Caspase-3、MMP2、MMP9蛋白相對(duì)表達(dá)

表2 不同濃度利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞中有關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s，n=9)

表2 不同濃度利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞中有關(guān)蛋白表達(dá)的影響(±s，n=9)

注：與NC比較，aP＜0.05。

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2.3 不同濃度利多卡因?qū)iR-146b-5p表達(dá)的影響 50 μmol/L 利多卡因組、100 μmol/L 利多卡因組、200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細(xì)胞的miR-146b-5p表達(dá)量分別為0.86±0.08、0.61±0.07、0.47±0.04，均少于NC 組的1.00±0.09，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.114，P＜0.05)。

2.4 anti-miR-146b-5p 對(duì)SNU-1 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染anti-miR-146b-5p后，anti-miR-146b-5p 組SNU-1 細(xì)胞的miR-146b-5p和CyclinD1 蛋白的表達(dá)量比anti-miR-NC 組低，Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)量比anti-miR-NC 組高，MMP2、MMP9 蛋白的表達(dá)量、增殖能力比anti-miR-NC 組低，凋亡率比anti-miR-NC 組高，且遷移和侵襲數(shù)量比anti-miR-NC 組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3和圖3。

圖3 anti-miR-146b-5p上調(diào)對(duì)SNU-1細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 anti-miR-146b-5p對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

表3 anti-miR-146b-5p對(duì)SNU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

注：與anti-miR-NC比較，aP＜0.05。

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2.5 miR-146b-5p 可以逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 miR-146b-5p+200 μmol/L 利多卡因組SNU-1 細(xì)胞的miR-146b-5p、CyclinD1 蛋白的表達(dá)量高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)量低于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，MMP2、MMP9蛋白表達(dá)量、增殖能力高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，凋亡率低于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，遷移和侵襲數(shù)量高于miR-NC+200 μmol/L 利多卡因組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表4和圖4。

圖4 miR-146b-5p可以逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表4 miR-146b-5p可以逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

表4 miR-146b-5p可以逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)NU-1細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響(±s，n=9)

注：1組，miR-NC+200 μmol/L利多卡因；2組，miR-146b-5p+200 μmol/L利多卡因；與1組比較，aP＜0.05。

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3 討論

麻醉劑也可能影響癌癥的進(jìn)展。利多卡因是一種常用的局部麻醉劑，其抗癌作用被廣泛報(bào)道。諸多研究揭示利多卡因不僅抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、加速細(xì)胞凋亡，還抑制細(xì)胞遷移和侵襲[10-11]。資料顯示，利多卡因通過(guò)調(diào)節(jié)miR-145 表達(dá)抑制胃癌MKN45 細(xì)胞的活力、增殖、遷移和侵襲，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡[12]。利多卡因通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞中的環(huán)狀RNA ANO5/miR-21-5p/LIFR軸導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移、侵襲減少，以及細(xì)胞凋亡增加[13]。在肝癌中，利多卡因通過(guò)靶向肝癌細(xì)胞中的環(huán)狀RNA DYNC1H1/miR-520a-3p/USP14 軸來(lái)阻止腫瘤進(jìn)展[14]。本研究探討了利多卡因?qū)ξ赴㏒NU-1 細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的抑制作用。根據(jù)本研究的數(shù)據(jù)，50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L 利多卡因顯著抑制SNU-1 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，但促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究一致。Cleaved Caspase-3 被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的因子[15]。MMP2、MMP9 是遷移和侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。本研究還發(fā)現(xiàn)利多卡因下調(diào)CyclinD1、MMP2 和MMP9 水平，同時(shí)促進(jìn)Cleaved Caspase-3 表達(dá)，與SUI 等[12]報(bào)道的利多卡因下調(diào)胃癌MKN45 細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 表達(dá)及上調(diào)Cleaved Caspase-3 表達(dá)一致?？傊?，本研究的數(shù)據(jù)與之前的結(jié)果一致，這為利多卡因抗胃癌作用提供了新的證據(jù)。

作為細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，miRNA參與控制包括胃癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲行為。miR-146b-5p是一種具有致癌[16]和腫瘤抑制活性[17]的癌癥相關(guān)miRNA。最近，有人提出miR-146b-5p在胃癌中的表達(dá)增加[18-19]，誘導(dǎo)miR-146b-5p 的下調(diào)有助于治療胃癌[9]或抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[20]。此外，miR-146b-5p 表達(dá)與晚期甲狀腺乳頭癌相關(guān)，miR-146b-5p 在體外促進(jìn)甲狀腺乳頭癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和細(xì)胞周期[21]?？梢?jiàn)miR-146b-5p是胃癌、甲狀腺乳頭癌等的腫瘤促進(jìn)劑。本研究的結(jié)果表明，沉默miR-146b-5p使SNU-1細(xì)胞的增殖能力、遷移和侵襲能力減弱，而凋亡水平增加，與前人研究[9，20]吻合。利多卡因使SNU-1 細(xì)胞中的miR-146b-5p 表達(dá)減少，猜測(cè)利多卡因可以通過(guò)降低miR-146b-5p水平來(lái)阻滯胃癌的發(fā)生發(fā)展。此前，一些miRNA被報(bào)道參與利多卡因的抗癌功能，如利多卡因抑制肺癌A549 和NCI-H1299細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制與上調(diào)miR-539有關(guān)[22]。利多卡因通過(guò)下調(diào)miR-10b減輕順鉑耐藥，并抑制胃癌順鉑耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲[23]。進(jìn)一步的結(jié)果表明，miR-146b-5p 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)了利多卡因誘導(dǎo)的SNU-1 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的降低和細(xì)胞凋亡的增加。此外，miR-146b-5p 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)了利多卡因誘導(dǎo)的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)蛋白的變化。因此，利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞具有抗生長(zhǎng)和抗轉(zhuǎn)移作用，其抗腫瘤特性可能是通過(guò)下調(diào)miR-146b-5p 實(shí)現(xiàn)的。

總之，本研究闡明了利多卡因在胃癌中發(fā)揮抗生長(zhǎng)和抗轉(zhuǎn)移作用的機(jī)制，利多卡因通過(guò)下調(diào)miR-146b-5p來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并加速凋亡，為利多卡因在胃癌中的作用機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。