基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶水解酶對肝纖維化的調(diào)控及相關(guān)治療藥物研究進展

黃 倩， 楊 燕， 曾 銳， 姚孟林， 孫 琴,2

1 西南醫(yī)科大學(xué) a.藥學(xué)院， b.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院， 四川 瀘州 646000;2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合藥物研究中心， 四川 瀘州 646000

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理過程。病毒感染、免疫或自身免疫疾病、飲酒、遺傳及藥物等均可能成為肝纖維化的誘發(fā)因素[1]。在這些因素作用下，正常肝細胞變性、壞死，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，最終刺激纖維組織增生而形成肝纖維化。

肝臟內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)(ECM)的沉積是肝纖維化的主要病理特征，其表現(xiàn)為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達遠高于正常水平[2]。ECM生成與水解的平衡是由基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)與基質(zhì)金屬蛋白酶水解酶(tissue inhibitors of metallopro-teinases, TIMP)調(diào)控的，當TIMP與MMP的表達失衡時，ECM的沉積可能加重，進而可能加快或加重肝纖維化[3]?，F(xiàn)階段肝纖維化的治療十分困難，目前尚無基于病理生理學(xué)治療肝纖維化的藥物，僅有扶正化瘀膠囊、復(fù)方鱉甲軟肝片、安絡(luò)化纖丸、強肝膠囊/丸、安琺特及肝爽顆粒等幾個中成藥被批準基于適應(yīng)證用于肝纖維化治療[4]。新藥的研發(fā)有賴于潛在治療靶點和潛在活性成分的發(fā)掘，故本文基于中國知網(wǎng)、萬方醫(yī)學(xué)網(wǎng)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫、PubMed及Web of science等數(shù)據(jù)庫，總結(jié)了近5年來基于MMP/TIMP的肝纖維化實驗研究及相關(guān)報道，分析通過MMP/TIMP發(fā)揮抗肝維化活性的組分及其作用機制，以期闡明MMP/TIMP與肝纖維化的關(guān)系，為肝纖維化治療靶點的發(fā)現(xiàn)及抗肝纖維化藥物的開發(fā)提供新的線索和理論支撐。

1 MMP與TIMP的結(jié)構(gòu)、分類及功能

1.1 MMP的結(jié)構(gòu)、分類及功能 MMP由鋅依賴性蛋白水解酶組成，可以降解ECM的組成成分，如層粘連蛋白、膠原、纖連蛋白等組分。MMP有3個共同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，分別是具有“半胱氨酸開關(guān)”的前肽結(jié)構(gòu)域、具有HEXGHXXGXXHS序列的催化鋅結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和類血紅素蛋白結(jié)構(gòu)域[5]。

目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)28種不同類型的MMP，其中至少有23種在人體組織中表達，其中結(jié)構(gòu)研究較為明確的共有22種，可被分為7類(圖1)[6]；作用底物研究較為明確的共有21種，可被大致分類6類(表1)。

注：信號肽、前肽及具有活化鋅的催化結(jié)構(gòu)是MMP的共性結(jié)構(gòu)。

表1 MMP主要功能分類表

MMP具有降解細胞外基質(zhì)蛋白、糖蛋白、膜受體及細胞因子等生物功能，可參與組織修復(fù)和再生、胚胎形成和發(fā)育、血管生成及傷口愈合等多種生物過程。MMP的表達或活性異常時，常常伴隨著不同疾病的發(fā)生，肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展主要與MMP-1、MMP-2、MMP-3及MMP-9等幾種酶的活性有關(guān)[7]。

1.2 TIMP的結(jié)構(gòu)、分類及功能 TIMP是MMP家族的抑制劑，由184～194個氨基酸組成，分子量為25～31 kD[8]。現(xiàn)代研究已發(fā)現(xiàn)的TIMP包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及TIMP-4四類。TIMP-3的表達較為廣泛，TIMP-1、TIMP-2主要在肝臟組織中表達，TIMP-4則只在腦、心臟、卵巢和骨骼肌等組織中少量表達。4種不同亞型的TIMP均能在一定程度上抑制MMP的活性，但其在結(jié)構(gòu)上卻存在一定的差異，如TIMP-2與TIMP-4在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似性，而TIMP-1的結(jié)構(gòu)較為獨特。TIMP-1主要抑制膠原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)的活性，同時TIMP-1可能對細胞的生長有一定的調(diào)節(jié)作用;TIMP-2過量時會抑制明膠酶原A的激活，但適量 TIMP-2對于明膠酶原A的激活似乎是必不可少的; TIMP-3能誘導(dǎo)腫瘤細胞和血管平滑肌細胞凋亡，TIMP-4的功能目前尚未明確[8]。

2 MMP/TIMP對肝纖維化的調(diào)控

2.1 MMP在肝纖維化中的作用 目前肝內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MMP共有8種，分別是MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12及MMP-13[9]，它們可直接或間接調(diào)控ECM的降解，在肝纖維化的形成與消退過程中有重要作用。MMP-1為間質(zhì)膠原酶，主要對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ膠原有較強的水解作用。有研究[10]表明，適當上調(diào)MMP-1的表達在一定程度上可以減緩肝纖維化的進程。MMP-2是一種明膠酶，由活化的肝星狀細胞(HSC)產(chǎn)生。而MMP-2的激活，是由MMP-14介導(dǎo)，其通過與Pro-MMP-2和TIMP-2在HSC細胞膜上形成三元聚合而發(fā)生。較多研究[11]認為，MMP-2在纖維化階段表達量升高，而在肝硬化與肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中逐漸降低。MMP-3在HSC活化的早期短暫表達，其可以通過剪切短肽的形式激活多種金屬蛋白酶，包括MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9和MMP-13等，對肝纖維的發(fā)生與發(fā)展有間接調(diào)控作用。而在急性和慢性肝損傷動物模型中，MMP-9的表達結(jié)果不一致。在單次注射CCl4引起的急性肝損傷中，注射后3 d內(nèi)活性MMP-9增加，而24 h后MMP-9基因表達無變化。在8周CCl4注射方案誘導(dǎo)的慢性肝損傷中，既沒有觀察到MMP-9 mRNA表達的變化，也沒有觀察到活化的MMP-9的出現(xiàn)。而在膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中，檢測到Pro-MMP-9的上調(diào)，這表明MMP-9對肝纖維化的影響與炎癥之間存在一定程度上的關(guān)聯(lián)[12]。

2.2 TIMP在肝纖維化中的作用 迄今為止，已知有4種TIMP對肝纖維化的形成有不同程度的影響。TIMP-1與TIMP-2和肝纖維化的相關(guān)性初次發(fā)現(xiàn)是在炎癥刺激下的大鼠肝細胞中；隨后，在CCl4、膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)TIMP-1和TIMP-2的表達增強，再次證實兩者與肝纖維的相關(guān)性[13]。慢性肝損傷動物模型強調(diào)TIMP-1對肝纖維發(fā)展的重要性[14]，過量表達TIMP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，經(jīng)CCl4處理后表現(xiàn)出更加嚴重的肝纖維化癥狀。另一方面，TIMP-1由TGFβ調(diào)控，其本身并不能誘導(dǎo)纖維化的發(fā)生。TIMP-1主要通過與MMP結(jié)合抑制膠原酶的活性，以免新合成的膠原被MMP立即降解，同時TIMP-1也能夠阻止活化的HSC中前體基質(zhì)金屬蛋白酶的激活[12]。顯然，TIMP-1在肝纖維化的調(diào)控中起著重要作用。TIMP-2與TIMP-1的表達情況類似，在原代培養(yǎng)的HSC中不表達，當HSC被活化后表達增強[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)在肝纖維化形成過程中MMP-2的表達增高,而TIMP-2的表達水平顯著低于MMP-2，從而使MMP-2的活性得不到抑制，而促進肝纖維化的不斷形成和發(fā)展。

2.3 MMP/TIMP對肝纖維化的調(diào)控 肝纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜，多種因素均可能誘發(fā)肝纖維化。目前研究認為，肝纖維化的發(fā)生與消退是由多種細胞因子與信號通路構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控的[16]。MMP/TIMP對肝纖維化形成與消退的影響與巨噬細胞關(guān)系密切，巨噬細胞在不同趨化因子的影響下可形成M1/M2型兩種類型的巨噬細胞，進而影響ECM的合成和水解[17]。另外，活化的HSC中TIMP-1的表達上調(diào)，MMP的活性受到抑制，ECM的降解減少，最終形成了ECM的過度沉積，進而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。而M1型巨噬細胞則在膠原纖維的溶解中起著重要作用。M1型巨噬細胞分泌MMP-9，可以通過調(diào)控HSC的凋亡，減少TIMP-1的分泌進而增強MMP的活性，以促進ECM的降解，另外M1型巨噬細胞還可以分泌MMP-13、MMP-12等細胞因子，增強對ECM的水解作用，進而抑制肝纖維化的進程[17]。

MMP與TIMP在肝臟中維持著一種平衡的狀態(tài)，當有過量ECM產(chǎn)生時， MMP會將其降解，同時TIMP又適當抑制著MMP的活性，不至于損傷正常肝臟組織，兩者共同維護著肝細胞微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。一旦有致病因子打破這種統(tǒng)一，則使兩者失衡，從而導(dǎo)致肝纖維化的形成與發(fā)展。

3 基于MMP/TIMP發(fā)揮抗肝纖維化作用的藥物

隨著對MMP/TIMP在肝纖維化機制中的認識，基于MMP/TIMP發(fā)揮治療肝纖維化的藥物研究逐漸增加，不少現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，許多藥物可以通過影響肝組織中MMP/TIMP的表達來減緩肝纖維化的進程，從而發(fā)揮抗肝纖維化的作用。本綜述從實驗?zāi)Ｐ蛯MP/TIMP的影響等方面將近5年報道的組分整理匯總，以期為闡明不同組分發(fā)揮抗肝纖維化的作用機制提供支持。

3.1 基于MMP/TIMP發(fā)揮抗肝纖維化作用的化學(xué)藥物 由于肝纖維化發(fā)病機制的復(fù)雜，針對單一靶標研發(fā)的藥物在臨床很難奏效，截至目前尚無療效明確的化學(xué)藥物或生物藥物可供臨床應(yīng)用。但近年來有實驗研究發(fā)現(xiàn)美洛昔康、尼洛替尼及氯沙坦3種藥物可能通過調(diào)節(jié)MMP/TIMP而在肝纖維化模型上發(fā)揮治療作用。Hassan等[18]基于CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，美洛昔康通過降低模型組大鼠中TIMP-1、TGFβ的表達而抑制膠原的沉積進而減輕肝纖維程度。據(jù)Karimi等[19]學(xué)者研究，尼洛替尼和氯沙坦聯(lián)用通過上調(diào)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠中MMP-2、MMP-9的表達發(fā)揮抗肝纖維化作用。

3.2 基于MMP/TIMP發(fā)揮抗肝纖維化作用的中藥 中藥在治療肝纖維化方面較西藥更具優(yōu)勢，其多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點使之成為了肝纖維化藥物研究的熱點[20]。近年在中藥復(fù)方的實驗研究中，李潔等[21]基于CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，發(fā)現(xiàn)加味茵陳四逆湯可以通過上調(diào)MMP-1及下調(diào)TIMP-1、TIMP-2的表達而減輕肝纖維的程度。李紹民等[22]研究認為，逍遙散含藥血清可使體外肝纖維化模型細胞表現(xiàn)出MMP-1上調(diào)及TIMP-1下調(diào)。另有研究[23-25]表明，柴胡疏肝散、鱉甲煎丸及清肝九味丸可以通過下調(diào)TIMP-1及上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達發(fā)揮抗纖維化的活性。

除中藥復(fù)方外，單味中藥在基于MMP/TIMP抗肝纖維化的實驗研究中進展迅速，如荔枝核總黃酮、籽瓜皮提取物、金釵石斛多糖、鱉甲提取物、溪黃草黃酮、白背葉根水提物、豆莢提取物等均被報道有上調(diào)MMP及下調(diào)TIMP而減緩肝纖維化進程的作用[26-31]。

3.3 基于MMP/TIMP發(fā)揮抗肝纖維化作用的天然產(chǎn)物 近年來，從天然產(chǎn)物中尋找或發(fā)現(xiàn)抗肝纖維化藥物和先導(dǎo)化合物已成為熱門的研究領(lǐng)域?？偨Y(jié)近5年的實驗研究共發(fā)現(xiàn)14種天然產(chǎn)物可通過調(diào)控MMP/TIMP發(fā)揮抗肝纖維化的作用(表2)。這些天然產(chǎn)物在不同因素引誘的肝纖維模型中均可通過調(diào)控MMP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13或TIMP-1、TIMP-2的表達進而發(fā)揮抗肝纖維化的作用，此外這些組分還調(diào)節(jié)其他肝纖維化相關(guān)細胞因子(如TGFβ1、TNFα等)的表達進而影響肝纖維化的進程。

表2 近5年基于TIMP與MMP發(fā)揮抗肝纖維化的天然產(chǎn)物研究情況

綜上，本文通過總結(jié)近5年來基于MMP/TIMP發(fā)揮抗肝纖維化作用的文獻報道，共計發(fā)現(xiàn)相關(guān)藥物30種，包括中藥復(fù)方、單味中藥及提取物、化學(xué)藥物及天然產(chǎn)物等，從構(gòu)成比來看，中藥及天然產(chǎn)物相關(guān)組分在MMP/TIMP介導(dǎo)的纖維消融平衡中有重要作用， 該結(jié)果與文獻報道的中醫(yī)藥治療肝病尤其在肝纖維化防治領(lǐng)域療效顯著一致[47]。 從作用機制來看它們主要是通過不同程度的調(diào)節(jié)MMP/TIMP的表達，尤其是MMP-1、MMP-2、MMP-9及MMP-13與TIMP1/2等的表達而發(fā)揮抗肝纖維化的作用?？傮w來說，中藥具有成分復(fù)雜、功效復(fù)雜等特點，與肝纖維化復(fù)雜的作用機制相適應(yīng)，在肝纖維化的治療上優(yōu)勢顯著，不少研究也證實多種組分可以通過調(diào)控關(guān)鍵蛋白、關(guān)鍵靶標及相關(guān)信號通路減輕肝纖維化的程度。但仍有許多問題值得注意：(1)中藥來源復(fù)雜、處理過程考究，因此某些活性物質(zhì)的含量在不同研究中可能存在較大差異，會對不同研究結(jié)果的比較與分析造成一定的困擾。(2)由于肝纖維化的動物模型及體外實驗研究的局限性，雖然抗肝纖維化藥物的實驗研究結(jié)果可觀，但最終療效及安全性仍需通過細致嚴格的臨床實驗驗證篩選。(3)由于中藥組分及功效的復(fù)雜性以及在治療肝纖維化上的多層次、多靶點優(yōu)勢，使得闡明中藥復(fù)方抗肝纖維化的機制仍具有極大的挑戰(zhàn)。

4 總結(jié)與討論

肝纖維化是多種肝病共同且可逆的病理過程，預(yù)防和治療肝纖維化對于防控肝硬化及肝癌有重要意義。由于肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展是由多種因子及信號通路共同調(diào)控，極具復(fù)雜性，而且動物模型的作用機制與人類肝纖維化的發(fā)病機制存在一定的差異性，故目前治療肝纖維化的藥物大都處于臨床前的研究階段，鮮有臨床驗證有效的藥物。

但隨著對肝纖維化作用機制研究的不斷深入，MMP/TIMP在肝纖維化中的作用引起了學(xué)者們的廣泛重視?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)MMP/TIMP可以不同程度地反映肝纖維化及肝硬化的進展情況，MMP/TIMP調(diào)控的膠原消融平衡，對早期診斷肝纖維化及逆轉(zhuǎn)肝纖維化有著重要的意義；同時研究表明肝纖維化的治療已經(jīng)從抗炎治療發(fā)展為以HSC為靶細胞的多模式結(jié)合治療。ECM的沉積是肝纖維化的一個重要特征，MMP可以降解ECM的不同組分，其天然抑制劑TIMP能與MMP的成員發(fā)生不同形式的結(jié)合而抑制其活性，通過抑制膠原合成及促進膠原的降解減少ECM的沉積，進而減慢肝纖維化的進展或逆轉(zhuǎn)肝纖維化。但目前MMP/TIMP在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中對ECM的調(diào)控作用、如何精準維持MMP/TIMP、調(diào)節(jié)MMP的活性、闡明MMP/TIMP平衡的機制等方面還需深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：黃倩、楊燕對研究的思路或設(shè)計有同等的關(guān)鍵貢獻；曾銳、張馨月、姚孟林參與了研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程；孫琴起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容。