苯丙氨酸羥化酶缺乏癥家系PAH基因新發(fā)突變分析

馬翠霞，封露露，李麗欣，馬倩倩，李 揚(yáng)，封紀(jì)珍

(1.石家莊市婦幼保健院 a.遺傳科；b.產(chǎn)前診斷科，河北 石家莊 050000；2.石家莊市婦產(chǎn)醫(yī)院 體檢中心，河北 石家莊 050000)

苯丙氨酸羥化酶缺乏和四氫生物蝶呤缺乏都會(huì)造成機(jī)體苯丙氨酸含量增高，引起高苯丙氨酸血癥(hyperphenylalaninemia，HPA)[1]。有研究顯示，我國(guó)新生兒疾病篩查中近90%的HPA病因?yàn)楸奖彼崃u化酶缺乏癥(phenylalanine hydroxylase deficiency，PAHD)[2]。而PAHD臨床表型復(fù)雜，新生兒期表現(xiàn)正常，出生后3～4個(gè)月皮膚逐漸變白，頭發(fā)逐漸變黃，汗液、尿液有特殊的鼠臭味，同時(shí)也會(huì)表現(xiàn)行為、神經(jīng)異常，對(duì)患兒智力造成的損害是永久性的，由于患兒缺乏典型的癥狀，可能會(huì)被誤診為神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。PAHD的病因是苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因發(fā)生突變，且PAH基因突變位點(diǎn)在不同區(qū)域、種族間存在明顯的差異[4-5]。本研究應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)和多重連接探針技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)對(duì)PAHD患兒及其父母基因組進(jìn)行測(cè)序，尋找PAH基因突變位點(diǎn)并進(jìn)行分析，旨在為PAHD家庭的遺傳咨詢提供有效的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1病例選擇 此PAHD家系由石家莊市新生兒疾病篩查診治分中心收集，共3名成員，先證者為女性，確診時(shí)出生45天，家系情況見(jiàn)圖1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署了相關(guān)的知情同意書。

圖1 PAHD家系圖

1.2基因測(cè)序

1.2.1提取DNA 使用德國(guó)Qiagen試劑盒提取受檢者靜脈血中DNA，并且使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行質(zhì)檢，若DNA質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)則不合格，不能進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建。鑒定按照以下標(biāo)準(zhǔn)：①DNA濃度≥30 ng/μl時(shí)，1.7≤OD260/280吸收的比值(a)<2.0，質(zhì)量等級(jí)為A級(jí)；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質(zhì)量等級(jí)為B級(jí)；a<1.5或a>2.3，質(zhì)量等級(jí)為C級(jí)。②20 μg/ml≤DNA濃度<30 μg/ml 時(shí)，1.7≤a<2.0，質(zhì)量等級(jí)為B級(jí)；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質(zhì)量等級(jí)為C級(jí)；a<1.5或a>2.3，質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)。③DNA濃度<20 μg/ml 時(shí)，質(zhì)量等級(jí)均為D級(jí)。

1.2.2構(gòu)建文庫(kù) 采用Covaris打斷法將檢測(cè)樣本打碎為小分子片段(100～700 bp)，將小片段DNA末端進(jìn)行加“A”修復(fù)，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。配置反應(yīng)體系，充分混勻離心后98 ℃預(yù)變性1個(gè)循環(huán)2 min，98 ℃變性8個(gè)循環(huán)30 s，65 ℃退火8個(gè)循環(huán)30 s，72 ℃延伸8個(gè)循環(huán)30 s，最后72 ℃延伸1個(gè)循環(huán)5 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化質(zhì)檢，若DNA質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)則不合格，不能進(jìn)行下一步。鑒定按照以下標(biāo)準(zhǔn)：①DNA濃度≥50 μg/ml 時(shí)，1.7≤a<2.0，質(zhì)量等級(jí)為A級(jí)；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質(zhì)量等級(jí)為B級(jí)；a<1.5或a>2.3，質(zhì)量等級(jí)為C級(jí)。②30 μg/ml ≤DNA濃度<50 μg/ml 時(shí)，1.7≤a<2.0，質(zhì)量等級(jí)為B級(jí)；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3，質(zhì)量等級(jí)為C級(jí)；a<1.5或者a>2.3，質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)。③DNA濃度<30 μg/ml 時(shí)，質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳于200～500 bp處呈現(xiàn)清晰條帶則建庫(kù)成功。

1.2.3捕獲目的區(qū)域 標(biāo)記生物素的探針與文庫(kù)DNA雜交，60 ℃孵育16 h以上，雜交后的探針共價(jià)結(jié)合鏈霉親和素修飾的磁珠，磁珠及攜帶的目的基因經(jīng)過(guò)磁力架的吸附作用達(dá)到洗脫純化富集目的基因的目的。

1.2.4上機(jī)測(cè)序 采用“橋式”擴(kuò)增反應(yīng)，NextSeq 500對(duì)加載到Flowcell測(cè)序芯片上的文庫(kù)自動(dòng)循環(huán)，采用末端可逆邊合成邊測(cè)序的方式，并對(duì)不同標(biāo)記的核苷酸測(cè)序，根據(jù)標(biāo)記的不同熒光信號(hào)確認(rèn)堿基種類，經(jīng)過(guò)數(shù)個(gè)循環(huán)后讀取完整的核酸序列，最終保證核酸序列質(zhì)量。

1.2.5生物信息分析 統(tǒng)計(jì)讀取次數(shù)數(shù)量和測(cè)序質(zhì)量，將處理后的數(shù)據(jù)與人基因組(hg19)進(jìn)行排序、比對(duì)、過(guò)濾，去除冗余讀取次數(shù)，降低假陽(yáng)性。對(duì)插入缺失標(biāo)記(Indel)附件中讀取次數(shù)重新比對(duì)，消除周邊假陽(yáng)性單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。通過(guò)重新計(jì)算堿基質(zhì)量值，對(duì)堿基進(jìn)行糾正，之后將SNP和Indel結(jié)果關(guān)聯(lián)到多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行注釋、解析。

1.2.6基因突變位點(diǎn)生物信息分析 根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(America College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)指南對(duì)基因測(cè)序檢測(cè)到的突變位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析，對(duì)于未報(bào)道的位點(diǎn)，使用SIFT、PolyPhen_2、REVEL等軟件進(jìn)行生物信息預(yù)測(cè)。

1.3MLPA 使用DNA提取試劑盒提取受試者核酸，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行質(zhì)檢，若DNA質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)則不合格，不能進(jìn)行下一步。鑒定按照以下標(biāo)準(zhǔn)：①DNA濃度≥30 μg/ml時(shí)，1.7≤OD260/280吸收的比值(a)≤2.0及2.02.3及1.0≤b≤2.0，質(zhì)量等級(jí)為C級(jí)。②21 μg/ml≤DNA濃度<30 μg/ml時(shí)，1.7≤a≤2.0及1.0≤b≤2.0，質(zhì)量等級(jí)為B級(jí)；1.5≤a<1.7或2.0≤a<2.3及1.0≤b≤2.0，質(zhì)量等級(jí)為C級(jí)；a<1.5或a>2.3及b<1.0，質(zhì)量等級(jí)為D級(jí)。③DNA濃度≤20 μg/ml時(shí)，質(zhì)量等級(jí)均為D級(jí)。DNA質(zhì)檢符合要求后變性，加入探針混合液和MLPA緩沖液，孵育雜交。產(chǎn)物與連接酶混合液孵育連接，加熱使酶失活。然后加入引物、dNTP和DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，最終將擴(kuò)增片段長(zhǎng)度和結(jié)果峰導(dǎo)入軟件并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1PAH基因測(cè)序 先證者PAH基因測(cè)序結(jié)果顯示：第6外顯子c.630T>G和第2外顯子c.61-1G>A。其中c.630T>G為錯(cuò)義突變，這一突變使PAH基因第210號(hào)所編碼的氨基酸發(fā)生改變，苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?(p.F210L)；c.61-1G>A為剪接突變。這兩個(gè)突變位點(diǎn)在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)為低頻變異，在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Gene Mutation Database, HGMD)中未見(jiàn)報(bào)道，見(jiàn)圖2～3。

圖2 PAHD患兒PAH基因外顯子6中c.630T>G錯(cuò)義突變(箭頭處為基因突變位置)

圖3 PAHD患兒PAH基因外顯子2中c.61-1G>A剪接突變(箭頭處為基因突變位置)

2.2生物信息及致病性分析 使用軟件SIFT、PolyPhen_2、REVEL對(duì)c.630T>G進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，分別為良性、有害、有害；對(duì)c.61-1G>A進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，分別為未知、未知、未知。C.630T>G為錯(cuò)義突變，Sanger驗(yàn)證家系分析顯示，先證者之父此位點(diǎn)雜合變異，其母無(wú)變異，ACMG指南初步判定其為臨床意義未明突變。c.61-1G>A為剪接突變，家系分析顯示先證者之父此位點(diǎn)無(wú)變異，其母雜合變異，ACMG指南初步判定其突變?yōu)橐伤浦虏⌒酝蛔儭?/p>

2.3氨基酸的保守性分析及蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)模式生物保守性分析，PAH基因第210號(hào)編碼的苯丙氨酸在人、黑猩猩、獼猴、家犬、黃牛、小白鼠、褐家鼠、雞、斑馬魚(yú)、果蠅、岡比亞按蚊、秀麗隱桿線蟲(chóng)、熱帶爪蟾中高度保守，見(jiàn)圖4。蛋白質(zhì)三維分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)PAH基因突變型NM＿000277 c.630T>G(p.F210L)第210號(hào)氨基酸附近氫鍵明顯減少，由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?，?jiàn)圖5。

圖4 不同物種中PAH基因第210號(hào)編碼的苯丙氨酸位點(diǎn)保守性

圖5 PAH基因蛋白三維分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 a.野生型PAHp.F210L; b.突變型PAHp.F210L

2.4MLPA結(jié)果 MLPA檢測(cè)電泳峰圖顯示先證者的PAH基因外顯子未發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)異常，見(jiàn)圖6。

圖6 MLPA檢測(cè)電泳峰圖 a.對(duì)照樣本；b.先證者

3 討 論

HPA是苯丙氨酸在代謝過(guò)程中PAH或其輔酶缺乏造成苯丙氨酸增高的一種代謝性疾病。隨著篩查技術(shù)的不斷提高，PAHD患兒的診斷由臨床癥狀逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘瘜W(xué)及基因診斷，其中基因診斷是HPA的確診方法。PAHD具有復(fù)雜的臨床表型，迄今為止，國(guó)際上已經(jīng)報(bào)告多達(dá)1 000種PAH基因突變類型，在我國(guó)人群中有100余種[6-7]。不同地區(qū)、不同人群中PAHD的發(fā)病率和突變位點(diǎn)均有很大差異[8]，我國(guó)也是如此，不同地區(qū)、人群的基因突變需要進(jìn)一步驗(yàn)證[9-11]。有研究顯示，我國(guó)北方漢族人群PAH基因突變的情況與其他民族存在差異[12]，突變位點(diǎn)在不同地區(qū)中也有所不同。青島PAH基因的突變熱點(diǎn)主要為c.728G>A、c.1068C>A、c.158G>A[13]；鄭州主要為c.728G>A、c.331C>T、c.611A>G[14]；唐山主要為c.728G>A、c.331C>T、c.782G>A[15]；而在我國(guó)南方一些地區(qū)，如安徽PAH基因的突變熱點(diǎn)主要為c.728G>A、c.158G>A、c.611A>G[16]，四川主要為c.728G>A、c.721C>T、c.611A>G[17]，以上分析結(jié)果顯示各個(gè)地區(qū)PAH基因突變位點(diǎn)不完全相同但又存在一定的聯(lián)系。

本研究PAHD患兒的突變方式為錯(cuò)義突變和剪接突變，突變位點(diǎn)在第6外顯子和第2外顯子：630號(hào)核苷酸由胸腺嘧啶變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤(c.630T>G)的錯(cuò)義突變，使第210號(hào)氨基酸發(fā)生明顯的改變。ACMG 指南對(duì)此突變判定為臨床意義未明，在ESP、EXAC和千人數(shù)據(jù)庫(kù)正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異。通過(guò)對(duì)先證者父母驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在PAH基因反式位置檢測(cè)到致病突變。先證者表型與單基因遺傳病高度符合，采用SIFT、PolyPhen_2、Mutation Taster軟件分析該突變位點(diǎn)位于PAH蛋白的高度保守區(qū)，氨基酸的變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變從而致病，預(yù)測(cè)軟件REVEL預(yù)測(cè)此突變有害，HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。c.61-1G>A為零效變異，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生明顯改變，ACMG指南判定為疑似致病性變異，這一突變可能導(dǎo)致基因功能喪失，在ESP、EXAC和千人數(shù)據(jù)庫(kù)正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)此變異；軟件REVEL預(yù)測(cè)為未知，HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。c.61-1G>A的剪接突變因外顯子剪接位點(diǎn)發(fā)生改變使對(duì)應(yīng)的外顯子縮短、丟失，SIFT、PolyPhen_2和REVEL蛋白功能預(yù)測(cè)軟件對(duì)此剪接突變預(yù)測(cè)結(jié)果均為未知，然而這一突變對(duì)人體的影響仍需要進(jìn)一步的研究、分析、確認(rèn)[18]。第6外顯子編碼的氨基酸位于蛋白質(zhì)的活性中心，所以這個(gè)區(qū)域發(fā)生大片段缺失時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響酶的活性，然而發(fā)生片段缺失的患兒較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究[19]。

對(duì)基因功能改變影響較大的突變有致病突變，反之為沉默突變。致病突變能夠嚴(yán)重影響基因編碼的氨基酸生物合成各個(gè)環(huán)節(jié)以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步對(duì)PAH催化活性產(chǎn)生影響。而發(fā)生沉默突變的基因堿基發(fā)生的改變可能使氨基酸發(fā)生改變，但不會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性和功能。NGS能夠檢測(cè)點(diǎn)突變和小片段缺失、插入，而MLPA雖然不適用于檢測(cè)未知點(diǎn)突變，但對(duì)缺失的大片段、重排能夠很好的檢出，這兩種技術(shù)聯(lián)合使用可有效提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。

疾病相關(guān)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，本研究PAHD患兒存在與疾病表型相關(guān)的疑似致病性突變，經(jīng)基因測(cè)序確診為PAHD，血苯丙氨酸濃度為2.4 mg/dl，診斷為輕度HPA，定期監(jiān)測(cè)苯丙氨酸濃度，最高為4.2 mg/dl?！陡弑奖彼嵫Y的診治共識(shí)》[20]指出，輕型HPA的治療可以暫緩，但是要定期監(jiān)測(cè)血苯丙氨酸濃度，如果兩次連續(xù)血苯丙氨酸濃度>6.0 mg/dl(360 μmol/L)，應(yīng)進(jìn)行低苯丙氨酸治療，治療后3～6個(gè)月對(duì)患兒進(jìn)行生長(zhǎng)發(fā)育評(píng)估，1歲、2歲、3歲、6歲時(shí)進(jìn)行智能發(fā)育評(píng)估，使其體格、智力接近或達(dá)到正常兒童的發(fā)育水平。在患兒感染一些疾病，如膿毒血癥、創(chuàng)傷和慢性腎功能衰竭時(shí)，需要嚴(yán)密監(jiān)測(cè)血苯丙氨酸濃度，可根據(jù)血苯丙氨酸濃度調(diào)整臨床治療方案[20]。如果后期對(duì)患兒進(jìn)行治療，尤其需要注意避免過(guò)度治療造成苯丙氨酸缺乏。苯丙氨酸作為人體必需的一種氨基酸，如果缺乏會(huì)造成皮膚損害、營(yíng)養(yǎng)不良、低蛋白血癥等，甚至危及生命[21]。通過(guò)早期篩查、規(guī)范治療，可以使患兒發(fā)育達(dá)到或接近正常兒童的水平。

本研究闡明了一個(gè)輕度HPA家系的未報(bào)道致病基因突變，擴(kuò)大了石家莊市苯丙酮尿癥尤其是輕度HPA患兒PAH基因的突變譜，對(duì)了解該病的發(fā)生、發(fā)展以及患兒家庭的遺傳咨詢提供有力的支持，對(duì)于c.61-1G>A影響PAH基因的作用機(jī)制也需要深入的研究。