蛋白激酶B通路、乙酰肝素酶、NADPH氧化酶在心肌缺血再灌注損傷中的作用及相互關(guān)系的研究進(jìn)展

尹惠陽，藺雪峰，韓軒茂

(1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院 研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2. 內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)一科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是因血管部分或全部閉塞引起組織缺血缺氧，血液再通后，分子氧突然向缺血組織再分布并進(jìn)一步損害缺血組織及周圍組織的一種獨特?fù)p傷反應(yīng)[1]。IRI的病理生理機制是目前研究的熱點[2]。常見的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的一種嚴(yán)重類型，其發(fā)病率和死亡率均較高。AMI最有效的治療方法是通過溶栓、血管成形術(shù)和冠狀動脈搭橋術(shù)等手段使缺血心肌血運重建，但是心肌IRI可引起諸多并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血/再灌注過程中，蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)及NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)不同程度地表達(dá)，并且相互作用，可能引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致IRI[3-5]。

1 Akt、HPSE、Nox在IRI中的作用

1.1Akt在IRI中的作用 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，已知3種亞型，分別為Akt1，Akt2及Akt3。Akt1和Akt3廣泛表達(dá)，而Akt2在胰島素敏感組織如棕色脂肪、骨骼肌和肝臟中表達(dá)，它們在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用[6]。Akt作為多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑，主要通過組成PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮作用[7]。PI3K/Akt信號通路涉及多種生理病理過程，參與細(xì)胞生長、代謝及腫瘤增殖侵襲等過程[8]。既往研究表明，細(xì)胞凋亡在IRI中起重要作用[9]。PI3K/Akt信號通路通過調(diào)節(jié)相關(guān)分子的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡、血管生成、血管舒張、新陳代謝等方面起重要作用[10]。

研究表明，在IRI過程中Akt作用于不同的下游因子來發(fā)揮不同生物學(xué)效應(yīng)。Sulaiman等[11]實驗證明，激活PI3K/Akt/GSK-3 RISK通路可以減輕心肌細(xì)胞的線粒體功能障礙，減輕心肌IRI。缺血/再灌注時，血管平滑肌細(xì)胞分泌重組人成纖維細(xì)胞生長因子，激活PI3K/Akt通路，Akt通過激活雷帕霉素復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin C1，mTORC1)，引起參與細(xì)胞增殖的各種mTORC1底物磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖。mTORC1的活化使缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白水平增加，進(jìn)一步增加血管內(nèi)皮生長因子的分泌，導(dǎo)致血管形成和內(nèi)皮細(xì)胞遷移[12]。同時，Akt抑制叉頭框蛋白O3a和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)等下游因子[13]，使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔減少，穩(wěn)定缺血/再灌注細(xì)胞中的線粒體膜電位，增加平滑肌細(xì)胞的增殖[14-15]。Akt還可以磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，eNOS在由生長因子和血管緊張素誘導(dǎo)的血管生成和血管通透性中起主要作用，其產(chǎn)生的NO具有血管舒張、保護(hù)心臟的作用[16]。

1.2HPSE在IRI中的作用 HPSE是唯一一種具有降解硫酸乙酰肝素(heparan sulfide，HS)能力的內(nèi)-β-葡萄糖醛酸酶，廣泛存在于多種細(xì)胞的細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中。HPSE酶促活性為催化切割HS蛋白的聚糖側(cè)鏈，有助于細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的重塑并促進(jìn)與HS連接的生長因子、細(xì)胞因子、酶等分子的釋放。HPSE還通過與跨膜蛋白的相互作用來觸發(fā)不同信號通路，發(fā)揮其非酶促作用[17]。病理情況下，如缺血/再灌注、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移、炎癥和纖維化，HPSE過表達(dá)[18]。

Masola等[19]研究發(fā)現(xiàn)，腎臟IRI時，腎小管和腎小球的HPSE增加，誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡和巨噬細(xì)胞向M1極化，促進(jìn)單核細(xì)胞活化，同時HPSE過表達(dá)觸發(fā)HS降解發(fā)揮其酶促活性，并調(diào)節(jié)多配體蛋白聚糖1(syndecan-1，SDC1)表達(dá)，HPSE與SDC1相互作用，誘導(dǎo)堿性成纖維細(xì)胞生長因子通過PI3K/Akt通路引起部分近端腎小管上皮細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。HPSE調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞促炎因子表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)，造成組織損傷，誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞死亡，促進(jìn)纖維化[20]。

1.3Nox在IRI中的作用 活性氧(reactive oxygen species，ROS)可調(diào)節(jié)多種氧化還原依賴性信號通路。而Nox是ROS生成所必需的酶，是細(xì)胞分化、生長、增殖及各種機制的重要調(diào)節(jié)劑[21]。在哺乳動物中，目前已知有7種Nox同工型，分別為Nox 1～5、Duox 1和Duox 2[22]。其中，Nox2和Nox4在干細(xì)胞和心肌細(xì)胞中大量表達(dá)，是心臟缺血/再灌注過程中產(chǎn)生ROS的主要來源，在心臟損傷和重塑的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[23-24]。Nox的主要作用是產(chǎn)生ROS參與氧化應(yīng)激[25]。ROS的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，低水平的ROS可以啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，對心臟起保護(hù)作用[26]。但心血管危險因素造成ROS產(chǎn)生過多，超過抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，將會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進(jìn)一步引起內(nèi)皮細(xì)胞活化和巨噬細(xì)胞浸潤，抑制內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO，促進(jìn)動脈粥樣硬化，參與細(xì)胞增殖、遷移及分化，進(jìn)一步加重血管疾病[27-28]。

Nox亞型在介導(dǎo)缺血再灌注后的氧化應(yīng)激和心肌損傷中起重要作用，抑制Nox活性可有效防止ROS過度產(chǎn)生。研究表明，Nox2和Nox4在缺血/再灌注時表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生超氧陰離子，在酶作用下轉(zhuǎn)化為H2O2[29]。超氧化物通過陰離子通道孔隙，導(dǎo)致NO降解、過氧亞硝酸鹽形成和蛋白質(zhì)酪氨酸硝化等。H2O2通過與過氧化物酶反應(yīng)，使酪氨酸磷酸酶等失活，引起細(xì)胞毒性。Nox在缺血和再灌注過程中均有參與，HIF-1α促進(jìn)Nox的活化，而氧化應(yīng)激進(jìn)一步增加HIF-1α的產(chǎn)生，形成正反饋，加重?fù)p傷。此外，再灌注后細(xì)胞還釋放磷脂酶A2、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和血管緊張素II等介質(zhì)來激活Nox產(chǎn)生ROS[30]。ROS可能導(dǎo)致炎細(xì)胞積聚，產(chǎn)生細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)Nox過表達(dá)，從而引起心臟、腦、胃腸等多種器官的再灌注損傷[5]。

2 Akt、HPSE、Nox在IRI中的相互作用

2.1HPSE介導(dǎo)PI3K/Akt通路 多項研究表明，HPSE可激活多種信號傳導(dǎo)途徑，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，其中HPSE誘導(dǎo)PI3K/Akt通路并增強Akt磷酸化最為常見。Ben-Zaken等[31]研究表明，HPSE對Akt/PKB的激活是由脂質(zhì)筏介導(dǎo)的。脂質(zhì)筏可能通過與整合素αVβ3和α5β1結(jié)合，并將其激活。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)家族包括FAK和富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase 2，PYK2)。整合素招募FAK和PYK2，誘導(dǎo)FAK在Tyr-397處及PYK2在Tyr-402處的自我磷酸化[32]。活化的FAK、PYK2與PI3K的p85亞基結(jié)合，使p85亞基活化，p85亞基激活PI3K的p110α亞基，引起PI3K磷酸化，導(dǎo)致磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2)磷酸化為3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3, 4, 5-trisphosphate，PIP3)，PI3K與Ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RAS)相互作用促進(jìn)了Akt磷酸化。Thr-308位點和Ser-473位點是Akt磷酸化最重要的位點。Riaz等[33]研究發(fā)現(xiàn)，HPSE介導(dǎo)Akt的Ser-473位點磷酸化，PIP3激活mTORC2并結(jié)合Akt，導(dǎo)致Akt的Thr-308位點部分激活，mTORC2引起Akt的Ser-473位點完全磷酸化，造成Akt磷酸化。

2.2Akt與Nox的相互促進(jìn)作用 PI3K/Akt通路的下游因子約有100多種蛋白質(zhì)，作用于不同的下游因子引發(fā)不同的生物學(xué)效應(yīng)。Nox是產(chǎn)生ROS引發(fā)氧化應(yīng)激的主要物質(zhì)，Nox與Akt之間相互作用，但是它們之間確切的上下游關(guān)系存在爭議。

已有多項研究表明，Akt促進(jìn)Nox激活和ROS產(chǎn)生[34-40]。Nakanishi等[34]研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)激活處于同一路徑，位于細(xì)胞膜去極化的下游，但在Nox激活的上游。PKC抑制劑與PI3K抑制劑作用相當(dāng)，兩種抑制劑的共同作用并不強于單獨使用，說明PI3K和PKC存在于相同的通路內(nèi)。Cai等[35]研究提示，PKC-δ可能作為Akt的上游起作用，參與Nox合成的調(diào)節(jié)。在非吞噬細(xì)胞中，PI3K/Akt通路激活后，Akt通過磷酸化S304和S328位點上的p47-phox，引起p47-phox磷酸化，通過將p47-phox和Rac-1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上來組裝膜Nox復(fù)合物，從而激活Nox[36-37]。Nox活化后，Nox通過與分子氧和NADPH的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子，將其還原為H2O2，Nox相關(guān)的胞質(zhì)蛋白與完整的膜亞基結(jié)合形成功能性酶，從而產(chǎn)生ROS[38]。Nox組裝和ROS過度產(chǎn)生除引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞死亡外，還會引起大量鈣內(nèi)流和血管收縮，導(dǎo)致血壓升壓[39-40]。

2.3Nox促進(jìn)PI3K/Akt通路激活 Nox和ROS主要通過誘導(dǎo)10號染色體上缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)降解、抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)來激活PI3K/Akt通路。脂質(zhì)可通過上調(diào)PTEN導(dǎo)致PIP3被磷酸化還原為PIP2，從而抑制PI3K/Akt信號通路，而過度的氧化應(yīng)激可以抑制負(fù)調(diào)控因子PTEN的活性來激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)[34]。Nox導(dǎo)致氧化應(yīng)激和H2O2產(chǎn)生增多，暴露于H2O2環(huán)境中的PTEN會失活，從而激活PI3K/Akt信號通路[41]。在缺氧H9C2細(xì)胞和原代心肌細(xì)胞中，Nox4促進(jìn)Akt磷酸化；PP2A通過絲氨酸473和蘇氨酸308位點對Akt進(jìn)行去磷酸化[42]。而Nox4可導(dǎo)致Src激酶激活，氧化半胱氨酸殘基上的PP2A，并下調(diào)PP2A活性，抑制Akt通路的負(fù)向調(diào)控，從而導(dǎo)致Akt活性增強[43]。ROS還可通過PTP調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號傳導(dǎo)[36]。另外，還有研究表明，Nox4還可通過激活A(yù)kt/mTOR和NFκB信號通路來誘導(dǎo)心肌肥大及纖維化，抑制Nox4可能是治療心臟重塑的潛在方法[44]。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，Akt作為多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑，受到多種上游因子及下游因子的調(diào)控，作用于不同因子，顯現(xiàn)出不同的作用。在IRI中，Akt對損傷的調(diào)節(jié)也是多方面的。Akt主要通過增強mTORC1、eNOS、GSK3β等下游因子來起到保護(hù)心臟作用。同時，還可以通過激活Nox引起氧化應(yīng)激，造成細(xì)胞損傷?，F(xiàn)有研究提示，HPSE、Akt、Nox均參與IRI，并且相互影響。由于HPSE與Nox擁有共同的信號通路(PI3K/Akt通路)，我們推測PI3K/Akt可能是HPSE和Nox4間的中介物質(zhì)，因此HPSE對Nox的調(diào)控仍值得關(guān)注。HPSE與Nox之間的相互作用及Akt是否起到核心中介作用有待進(jìn)一步深入研究。心肌IRI中，HPSE是否通過PI3K/Akt信號通路，調(diào)控缺血/再灌注心肌細(xì)胞Nox的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用機制的相關(guān)研究十分匱乏，需要進(jìn)一步研究發(fā)掘。