根際促生菌-黑麥草聯(lián)合修復(fù)重金屬Pb污染土壤

焦鄭同， 朱 琳， 鄒海明， 王 艷

(安徽科技學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)現(xiàn)代化的快速發(fā)展,人類(lèi)活動(dòng)產(chǎn)生的污染物伴隨著降水、地表徑流等遷移到土壤當(dāng)中,導(dǎo)致土壤中污染物的積累,造成了各種土壤環(huán)境問(wèn)題[1]。其中,最為顯著的就是重金屬污染問(wèn)題,全球范圍內(nèi)多種重金屬元素的平均排放水平嚴(yán)重超標(biāo),重金屬污染情況極其嚴(yán)峻[2-3]。歐盟的農(nóng)業(yè)用地中有超過(guò)1 370萬(wàn)公頃的土地遭受不同程度的重金屬污染并亟需治理。目前,我國(guó)土壤重金屬污染情況十分嚴(yán)峻,自然資源部報(bào)告稱(chēng),截至2020年,我國(guó)重金屬污染土壤已達(dá)2 000萬(wàn)公頃左右,占耕地面積的10%以上。由于重金屬在土壤中具有滯后性、累積性、不可逆性、長(zhǎng)期性及毒害性等特點(diǎn)[4],富集在土壤中的重金屬無(wú)法降解,對(duì)土壤功能、人類(lèi)身體健康等構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[5]。盡管重金屬因其自身特性,在土壤中遷移性較差,但經(jīng)過(guò)雨水的洗滌會(huì)隨著水流進(jìn)入地表徑流或地下水,形成面源污染,對(duì)生態(tài)功能結(jié)構(gòu)以及人類(lèi)的身體健康產(chǎn)生危害[6-7]。因此,如何有效修復(fù)重金屬污染的土壤已成為環(huán)境研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8]。

植物修復(fù)是一種通過(guò)植物對(duì)土壤中重金屬的固定、吸收等作用對(duì)污染土壤進(jìn)行修復(fù)的一種技術(shù),因其成本效益及環(huán)境友好性被科學(xué)界認(rèn)可。在選擇重金屬污染修復(fù)所用植物時(shí),應(yīng)根據(jù)污染區(qū)域的具體情況,篩選在重金屬污染區(qū)域受毒害影響不明顯、對(duì)重金屬擁有較強(qiáng)富集能力的植物[9]。超積累植物(hyperaccumulator)是指地下部分可從土壤中吸收超量的重金屬,并將其轉(zhuǎn)移到地上部分,地上部分所含重金屬超過(guò)一般植物地上部分100倍以上[10]。但是受到超積累植物其本身生物量和生長(zhǎng)周期等因素的制約,植物修復(fù)需要漫長(zhǎng)的過(guò)程,其大規(guī)模應(yīng)用有待進(jìn)一步的研究[11-12]。因此,如何提高植物修復(fù)的效率是使用植物修復(fù)技術(shù)來(lái)進(jìn)行污染土壤修復(fù)亟待解決的問(wèn)題。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)是指生活在土壤或定殖于植物根際,并通過(guò)分泌植物激素、鐵載體等方式促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆性的有益菌[13]。根際促生菌可以增加ACC脫氨酶的活性,分解在逆境中植物產(chǎn)生的乙烯合成前體ACC,降低乙烯的濃度,從而緩解植物的不良反應(yīng)[14]。同時(shí)根際促生菌液可以分泌生長(zhǎng)素IAA、赤霉素GA等多種植物激素來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)[15]。Ahmad等[16]研究發(fā)現(xiàn),根瘤菌及假單胞菌混合接種可提高綠豆光合作用率、水的利用效率以及葉綠素含量,降低高鹽度對(duì)植株生長(zhǎng)的不利影響,促進(jìn)綠豆植株生長(zhǎng)、提高果實(shí)質(zhì)量。Lim等[17]等研究發(fā)現(xiàn),接種PGPR菌株地衣芽孢桿菌K11的胡椒植株耐受干旱脅迫的能力增強(qiáng)。劉東昀等[18]篩選出根際促生菌-Enterobactersp.EG16,該菌能分泌鐵載體,緩解鎘對(duì)植物的脅迫,并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Bacillussp.E5與叢枝菌根真菌共同接種會(huì)增加生菜的抗旱能力。

微生物-植物聯(lián)合修復(fù)是目前提高植物修復(fù)效率最主要的方法,近年來(lái)發(fā)展迅速[19]。研究表明,植物與微生物共存能增強(qiáng)植物的重金屬抗性,擁有較理想的修復(fù)效果[20]。一方面,部分微生物可促進(jìn)植物的生長(zhǎng),增強(qiáng)植株抗逆性;另一方面,植物在抗重金屬過(guò)程中也能提高這些微生物的抗重金屬能力[21],使微生物在重金屬脅迫條件下仍能存活,并發(fā)揮促進(jìn)植株生長(zhǎng)、增強(qiáng)植株抗逆性的作用。盧琪等[22]研究發(fā)現(xiàn)樊慶生紅球菌對(duì)于超積累植物東南景天修復(fù)重金屬污染土壤方面具有顯著性的有益效果。Hassan等[23]研究發(fā)現(xiàn),根際細(xì)菌菌株AN8可以顯著的減少鉛污染的毒害效果。Grobelak等[24]研究發(fā)現(xiàn)根際促生細(xì)菌Agrostiscapillari在 Pb、Zn、Cd等混合重金屬脅迫條件下,能顯著提高油菜花的存活率。

本研究通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)研究根際促生菌(樊慶生紅球菌,Rhodococcusqingshengii)與超積累植物黑麥草聯(lián)合修復(fù)重金屬鉛污染土壤的能力,旨在為利用黑麥草進(jìn)行重金屬污染土壤的修復(fù)及后續(xù)應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為安徽科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的Rhodococcusqingshengii(樊慶生紅球菌)。從-80 ℃冰箱取出甘油保存的菌株后,于LB(Luria-Bertan)培養(yǎng)基中活化?；罨恋诙笕? mL接種于50 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基于恒溫震蕩箱(轉(zhuǎn)速200 r/min,溫度30 ℃)中培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)后的菌液于高速冷凍離心機(jī)中離心,離心速度3 000 r/min,離心時(shí)間10 min收獲菌體,并用0.9%無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,使用無(wú)菌生理鹽水溶解為菌懸液。通過(guò)紫外可見(jiàn)光光度法測(cè)定菌懸液濃度。本研究中菌懸液吸光度為0.177。

供試植株為一年生黑麥草,種子購(gòu)買(mǎi)于浙江寧波某種業(yè)公司。播撒前,使用75%乙醇溶液表面消毒15 min,并用無(wú)菌水沖洗3次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)組處理以及對(duì)照組設(shè)置 使用營(yíng)養(yǎng)土種植黑麥草進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),共設(shè)置6個(gè)處理,分別為：土壤中不含外源鉛不接種菌液(CK)、土壤中不含外源鉛接種菌液(CK+R)、模擬農(nóng)業(yè)污染土壤不接種菌液(C1)、模擬農(nóng)業(yè)污染土壤接種菌液(C1+R)、模擬林業(yè)污染土壤不接種菌液(C2)、模擬林業(yè)污染土壤接種菌液(C2+R),每個(gè)處理9次重復(fù)。其中模擬林業(yè)污染土壤中Pb的終濃度為4 689.45 mg/kg,模擬農(nóng)業(yè)鉛污染土壤中Pb的終濃度為745.98 mg/kg。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組含營(yíng)養(yǎng)土395 g,放置4個(gè)月老化穩(wěn)定后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 植物的培養(yǎng) 將一年生黑麥草種子均勻播撒于土壤表面中,在種子上覆一層薄土,澆水50 mL。每盆樣品100粒種子。在植物生長(zhǎng)期間,每隔一段時(shí)間用等量超純水澆灌生長(zhǎng)基質(zhì),以保持土壤濕潤(rùn)。

1.2.3 根際微生物施加 在黑麥草生長(zhǎng)兩周后,向預(yù)接種樊慶生紅球菌的實(shí)驗(yàn)組(CK+R、C1+R、C2+R)中施加40 mL菌懸液。向未接種樊慶生紅球菌的實(shí)驗(yàn)組(CK、C1、C2)澆灌40 mL生理鹽水。

1.2.4 樣品采集 黑麥草在根際接種菌液生長(zhǎng)2周后,收獲植物,盡量保持黑麥草根系的完整,用去離子水沖洗后,觀(guān)察、測(cè)量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

黑麥草樣品進(jìn)行重金屬含量測(cè)定前,將分離的黑麥草地上部與地下部洗凈后分別裝入信封,使用烘箱105 ℃殺青30 min,75 ℃烘干至恒重后磨成粉末過(guò)篩裝入密封袋備用。

使用微波消解法[25]處理樣品，將聚四氟乙烯消化管在鹽酸溶液中浸泡12 min,清洗干凈用超純水潤(rùn)洗、烘干,向各個(gè)消化管內(nèi)加入0.1 g研磨后過(guò)篩的樣品,然后加入10 mL濃硝酸、3 mL濃鹽酸、2 mL氫氟酸。將聚四氟乙烯消化管放入微波消解爐中,使用扳手固定,消解50 min。消解完成后取出消化管,待其冷卻至室溫,向消化管中加入2 mL雙氧水放入趕酸儀中進(jìn)行趕酸。溫度設(shè)置為170 ℃,待消化管中剩下2 mL以下的溶液后,趕酸完成。取出消化管,冷卻至室溫后,將消化管中的液體倒入25 mL比色管中,用1%的稀硝酸潤(rùn)洗消化管并定容至25 mL,過(guò)濾后用于ICP-OES(電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀)上機(jī)測(cè)定。

吸取1 000 μg/mL鉛標(biāo)液定容,使標(biāo)線(xiàn)濃度達(dá)到1、5、10、15、20 μg/mL,用于ICP-OES標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制,并使用ICP-OES對(duì)消解后的樣品進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑麥草生長(zhǎng)情況變化

黑麥草生長(zhǎng)狀況如圖1所示,CK、CK+R、C1、C1+R組黑麥草地上部無(wú)明顯差異,與CK、CK+R相比,C2、C2+R實(shí)驗(yàn)組的地上部長(zhǎng)度為對(duì)照的84.7%、77.8%?？梢?jiàn)樊慶生紅球菌的施加對(duì)于植物的生長(zhǎng)無(wú)負(fù)面影響,且黑麥草在鉛脅迫環(huán)境中抗逆性較強(qiáng)。將C2+R與C2對(duì)比,C2+R組黑麥草地上部長(zhǎng)度僅為C2的88.5%,在接種菌液后黑麥草地上部生長(zhǎng)受到抑制,這與王元昌等[14]亞麻接種根際促生菌富集鎘砷地上部分生長(zhǎng)受抑制結(jié)果相同。

接種了樊慶生紅球菌的CK+R、C1+R、C2+R實(shí)驗(yàn)組地下部與未接種的CK、C1、C2實(shí)驗(yàn)組相比增幅18.5%、15.3%、22.4%,說(shuō)明樊慶生紅球菌擁有促進(jìn)植物地下部生長(zhǎng)的作用,提高了植物的抗逆性。與李靖等[26]根際促生菌增強(qiáng)巨菌草地下部生長(zhǎng)結(jié)果相同。與吳慧麗等[27]將根際促生菌接種至黑麥草根系,黑麥草株高增加結(jié)果相同。與C2相比C2+R組根部受到促進(jìn),表明在高鉛脅迫的林業(yè)土壤中樊慶生紅球菌仍能存活,并起到增強(qiáng)植物抗逆性的作用。將C1、C1+R與CK、CK+R相比可發(fā)現(xiàn)C1、C1+R實(shí)驗(yàn)組黑麥草地下部長(zhǎng)度為空白對(duì)照組的96%、93.8%,將C2、C2+R實(shí)驗(yàn)組與CK、CK+R相比可發(fā)現(xiàn),C2、C2+R的地下部長(zhǎng)度僅為空白對(duì)照的82.7%、85.4%,結(jié)果表明樊慶生紅球菌對(duì)黑麥草地下部生長(zhǎng)的促進(jìn)效果與重金屬Pb含量成反比。接種微生物后生物量有明顯增加,說(shuō)明微生物能有效緩解 Pb對(duì)植株的毒害,提高植株抗逆性,使植株可正常生長(zhǎng),這與張勝爽[28]研究結(jié)果一致。

接種樊慶生紅球菌促進(jìn)了黑麥草地下部分的生長(zhǎng),但其地上部分無(wú)明顯變化甚至受到抑制(圖1),這可能一方面是實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短,地下部分未生長(zhǎng)至最終形態(tài),對(duì)養(yǎng)分消耗較大,使得葉片無(wú)法吸收足夠的養(yǎng)分生長(zhǎng)。另一方面根際促生菌促進(jìn)地下部分生長(zhǎng)后,地下部分在吸收養(yǎng)分的同時(shí)對(duì)重金屬起到了超量富集的作用,鉛的脅迫使得黑麥草葉片無(wú)法良好生長(zhǎng)。

圖1 黑麥草生長(zhǎng)狀況

2.2 植株各部位重金屬含量結(jié)果分析

黑麥草地上部重金屬含量的變化情況見(jiàn)表1,在模擬農(nóng)田鉛污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)組中,C1+R組黑麥草地上部鉛含量與C1相比明顯增加,增長(zhǎng)率為104%。在模擬林業(yè)鉛污染土壤修復(fù)組中,將C2+R與C2相比,可發(fā)現(xiàn)黑麥草地上部鉛含量存在一定程度的增長(zhǎng),增長(zhǎng)率為30%。結(jié)果表明接種樊慶生紅球菌后黑麥草地上部重金屬鉛含量顯著增加,這說(shuō)明根際接種樊慶生紅球菌對(duì)植株富集重金屬鉛有著促進(jìn)作用,可以提高植株修復(fù)重金屬污染土壤的效率,但接種樊慶生紅球菌對(duì)黑麥草吸收重金屬鉛的促進(jìn)作用隨著土壤中重金屬含量的增長(zhǎng)緩慢降低,說(shuō)明黑麥草富集的重金屬鉛對(duì)于黑麥草的生長(zhǎng)存在毒害作用,但黑麥草自身抗鉛脅迫能力較強(qiáng),同時(shí)接種樊慶生紅球菌后增強(qiáng)了黑麥草抗逆性,確定了樊慶生紅球菌-黑麥草聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤是一條可行的道路。

黑麥草地下部鉛含量如表1所示,在模擬農(nóng)田鉛污染土壤修復(fù)組中,與C1相比,C1+R的地下部鉛含量增幅為2.3%。在模擬林業(yè)鉛污染土壤修復(fù)組中,與C2相比,C2+R的地下部鉛含量增幅為2.2%。結(jié)合表1地上部鉛含量可知,雖然接種樊慶生紅球菌后黑麥草地下部鉛含量增長(zhǎng)率較低,但黑麥草地下部鉛含量遠(yuǎn)高于地上部鉛含量,說(shuō)明黑麥草富集重金屬鉛的主要部位為地下部。本試驗(yàn)中,接種樊慶生紅球菌后能增加一年生黑麥草的鉛含量,這一現(xiàn)象可以解釋為,一方面接種樊慶生紅球菌促進(jìn)黑麥草地下部生長(zhǎng),從而強(qiáng)化黑麥草對(duì)重金屬的富集能力,另一方面樊慶生紅球菌接種活化土壤中的鉛,促進(jìn)了黑麥草對(duì)鉛的吸收,進(jìn)一步導(dǎo)致了鉛的高積累。與孫楠等[29]接種根際微生物,致使桂花和梔子花體內(nèi) 鉛、Cd 含量隨外源重金屬添加量增加而增加,均表現(xiàn)為地下部高于地上部結(jié)果相同。

表1 黑麥草植株P(guān)b含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)樊慶生紅球菌與黑麥草聯(lián)合修復(fù)技術(shù)對(duì)鉛污染土壤進(jìn)行修復(fù),得到以下結(jié)論:

(1)在相同培養(yǎng)條件下,相較于對(duì)照組CK,CK+R處理組中黑麥草長(zhǎng)勢(shì)未有明顯變化,說(shuō)明接種菌液對(duì)黑麥草的生長(zhǎng)無(wú)負(fù)面影響。C1、C1+R模擬農(nóng)田污染處理組與對(duì)照組CK相比,地上部分無(wú)明顯變化。而比較模擬林業(yè)污染土壤(C2、C2+R處理組)與對(duì)照組(CK、CK+R),可發(fā)現(xiàn)高濃度鉛污染將對(duì)黑麥草的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定程度的抑制。比較模擬林業(yè)污染土壤中C2+R處理組與C2,可發(fā)現(xiàn)在接種菌液后,由于黑麥草富集了過(guò)量重金屬,導(dǎo)致其地上部生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。

(2)在相同培養(yǎng)條件下,相較于CK、C1、C2的實(shí)驗(yàn)組,根際接種樊慶生紅球菌的處理組CK+R、C1+R、C2+R中,黑麥草地下部的生長(zhǎng)明顯受到促進(jìn),增長(zhǎng)率分別為18.5%、15.3%、22.4%。說(shuō)明樊慶生紅球菌有助于地下部的生長(zhǎng),有利于植株從土壤中吸收養(yǎng)分、富集重金屬,對(duì)植株在逆境中的生長(zhǎng)有著積極的促進(jìn)作用。

(3)在模擬農(nóng)業(yè)土壤中,根際接種樊慶生紅球菌的黑麥草(C1+R)植株地上部及地下部鉛含量與未接種菌液的處理組(C1)相比,分別增加了104%、2.3%。在高污染的林業(yè)土壤中,C2+R實(shí)驗(yàn)組地上部、地下部與C2實(shí)驗(yàn)組相比,鉛含量分別增加了30.25%、2.2%。說(shuō)明根際施加樊慶生紅球菌有利于黑麥草對(duì)于重金屬鉛的富集。

綜上所述,樊慶生紅球菌促進(jìn)了黑麥草對(duì)于重金屬鉛的吸收,樊慶生紅球菌-黑麥草聯(lián)合修復(fù)技術(shù)可以用于修復(fù)鉛污染土壤,為土壤重金屬污染修復(fù)提供新方法,并為微生物菌劑的研發(fā)提供新思路。