高表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯茶樹種質(zhì)資源的篩選與評(píng)價(jià)

陳瀟敏，金 珊，吳文晞，邵淑賢，王淑燕，王鵬杰，趙 峰，葉乃興

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建恒正檢測技術(shù)有限公司，福建 福州 350100；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

0 引言

【研究意義】兒茶素類化合物具有抗衰老、抗炎癥、抗菌、抗病毒及抗氧化等功效[1-2]，是茶葉生物化學(xué)研究最廣泛、最深入的一類物質(zhì)。兒茶素類主要包括表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），其中，EGCG 抗氧化性最為突出[3-4]。表沒食子兒茶素-3-O（3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me）是在20 世紀(jì)末從茶葉中新發(fā)現(xiàn)的一種天然被修飾的兒茶素物質(zhì)，相較于其他常見的EGCG、EGC、ECG 和EC，它的抗過敏和消炎等藥理作用更強(qiáng)，尤其是花粉過敏反應(yīng)的抑制效果極佳[5]。福建省為我國最大產(chǎn)茶省，茶樹栽培歷史悠久，野生茶樹種質(zhì)資源尤其豐富[6-8]。對(duì)福建野生茶樹資源進(jìn)行系統(tǒng)全面的兒茶素組分測定及分析，篩選出高EGCG、高EGCG3″Me 等特異資源，對(duì)福建野生茶樹資源的高效利用與甲基化兒茶素的研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG 經(jīng)甲基化、?；?、糖苷化修飾后，其消炎、抗過敏性等藥理作用會(huì)被顯著提高[9-12]。日本學(xué)者研究顯示紅富貴、紅富士和紅譽(yù)這3 個(gè)茶樹品種中EGCG3″Me 含量可超過1%[13]。近年來，我國茶葉科技工作者也通過篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列含有此類甲基化兒茶素的種質(zhì)資源[14-15]。例如，Jin 等[6]在福建省南部發(fā)現(xiàn)一類白芽茶富含EGCG3″Me，陳瀟敏等[16-17]對(duì)福建省大田、云霄茶樹品種資源進(jìn)行生化成分分析，發(fā)現(xiàn)兩地的茶樹品種資源均含有EGCG3″Me，并篩選出兒茶素組分特異資源?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組在福建省境內(nèi)不同區(qū)域共收集獲得43 份野生茶樹資源，已對(duì)其嘌呤生物堿組分進(jìn)行測定及系統(tǒng)分析[18]，其兒茶素組分則有待進(jìn)一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)課題組在福建省云霄、大田等7 個(gè)縣（市、區(qū)）搜集到的43 份野生茶樹種質(zhì)資源兒茶素組分的系統(tǒng)分析，進(jìn)而篩選獲得其中高EGCG、高EGCG3″Me 的特異茶樹種質(zhì)，旨在為高功能成分茶樹品種選育和高EGCG、高EGCG3″Me 產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以43 份福建野生茶樹資源和8 個(gè)主要栽培品種，共51 份種質(zhì)資源為供試茶樣。43 份福建野生茶樹資源樣品（野生茶）采集自福建云霄、大田、尤溪、蕉城、詔安、漳平以及安溪等7 個(gè)產(chǎn)區(qū)，8 個(gè)常規(guī)生產(chǎn)栽培品種分別為福鼎大白茶、福云6 號(hào)、黃旦、黃觀音、黃金芽、龍井43、白葉1 號(hào)及嘉茗1 號(hào)，均采集自武夷學(xué)院茶樹種質(zhì)資源圃（北緯27°44′20″，東經(jīng)117°59′51″）。供試材料信息見表1。采集過程參照《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[19]，于2021 年采摘春季第1 輪茶樹新梢的一芽二葉，冷凍干燥后粉碎過60 目篩。

表1 供試茶樹種質(zhì)資源信息Table 1 Information on tea germplasms

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methylgallate),EGCG3″Me]、兒茶素（Catechin，C）、表兒茶素（Epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechingallicacid，EGCG）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechingallate，ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Callocatechingallate,GCG）、兒茶素沒食子酸酯（Catechingallate，CG）標(biāo)樣（純度≥98%，上海，源葉生物科技有限公司），甲醇（色譜級(jí)，上海默克化工技術(shù)有限公司），甲酸（色譜級(jí)，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。

1.3 儀器設(shè)備

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國，賽默飛世爾科技公司），二級(jí)管陣列檢測器（DAD），C18反相色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（中國，廣州菲羅門公司）；AB204-N 分析天平（美國，梅特勒公司）；超純水系統(tǒng)（中國，Medium Touch，上海和泰儀器有限公司）。KQ-800E 型超聲波清洗器（中國，昆山市超聲儀器有限公司）；MS3 basic 渦旋振蕩儀[中國，艾卡（廣州）儀器有限公司]。

1.4 兒茶素組分測定

參照王麗麗等[20]的高效液相色譜法。前處理：稱取0.200 g 粉碎樣（過100 目篩），加30 mL 甲醇，渦旋，室溫下超聲提取30 min，4 ℃，10 000 r·min-1冷凍離心5 min，上清液過0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜。色譜條件：流動(dòng)相A 為0.2%甲酸-水溶液（V∶V），流動(dòng)相B 為甲醇；流速1.00 mL·min-1；柱溫，40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件，0～2 min，88% A；2～10 min，88%～75% A；10～15 min，75%～73% A；15～25 min，73%～68% A；25～30 min，68% A；30～32 min，68%～88% A。檢測器波長280 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)參試資源品種，分別采集3 批次，測定后，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示其兒茶素組分含量；使用Microsoft Excle 2018（美國，Microsoft 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及表格制作；以O(shè)rigin 2018（美國，OriginLab 公司）制作折線圖；采用SIMCA P14.1軟件（瑞典，Umetrics AB 公司）進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。使用MetaboAnalyst 5.0（https://www.metaboanalyst.ca.）在線分析平臺(tái)進(jìn)行聚類熱圖的繪制。兒茶素總量（Total catechins，TC）=EGCG3 ″Me+ECG+EGCG+GCG+CG+C+GC+EGC+EC。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建野生茶樹資源兒茶素組分含量分析

通過對(duì)43 份福建野生茶樹資源兒茶素組分進(jìn)行基本的統(tǒng)計(jì)分析，9 種兒茶素組分標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的液相色譜圖見圖1，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2，表明茶樣中EGCG含量均為最高，YX06、ZP01中則富含EGCG3″Me；GCG、CG、GC 在供試樣中含量均較低或未檢出。

表2 43 份福建野生茶樹資源及8 個(gè)栽培品種兒茶素組分含量Table 2 Catechins in 43 wild tea germplasms in Fujian and 8 cultivated varieties （單位：mg·g-1）

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及參試樣品的色譜Fig. 1 Chromatograms of standards and test samples

對(duì)43 份福建野生茶樹資源及8 個(gè)栽培品種兒茶素組分含量進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表3，從兒茶素組分的構(gòu)成上看，43 份福建野生茶樹資源與8 個(gè)栽培品種相同，是以表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）為主要組分，均未檢測到兒茶素沒食子酸酯（CG），含有少量的沒食子兒茶素（GC）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）。與栽培品種不同的是，在43 份福建野生茶樹資源中，均檢出表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me），其中以云霄6 號(hào)（YX06）含量最高，為33.65 mg·g-1，而在栽培品種中，金觀音（JGY）和黃旦（HD）含有少量的表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me），其余栽培品種均未檢測該物質(zhì)?？梢?，福建野生茶樹資源富含表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me）。

以43 份福建野生茶樹資源和8 個(gè)栽培品種兒茶素各組分含量的平均值為數(shù)據(jù)，繪制柱狀圖并進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果如圖2 所示。福建野生茶樹資源與栽培品種在非酯型兒茶素含量中均無明顯差異，其中，福建野生茶樹資源的沒食子兒茶素（GC）和兒茶素（C）含量略高于栽培品種，而表沒食子兒茶素（EGC）和表兒茶素（EC）含量略低于栽培品種。福建野生茶樹資源的酯型兒茶素含量均高于栽培品種，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me）極顯著高于栽培品種。

圖2 供試資源兒茶素組分含量Fig. 2 Content of tea germplasms in catechin components

2.2 正交偏最小二乘判別分析 (OPLS-DA)

對(duì)福建野生茶樹資源和栽培品種的兒茶素組分進(jìn)行OPLS-DA 分析。在圖3-A 中，除了漳平11 號(hào)（ZP11）以外，其余福建野生茶樹資源與栽培品種可以較好區(qū)分。其中福建野生茶樹資源與栽培品種金觀音（JGY）、黃旦（HD）、福鼎大白茶（FD）距離較近，與栽培品種龍井43（LJ43）、白葉1 號(hào)（BY1）、嘉茗1 號(hào)（JM1）、黃金芽（HJY）距離較遠(yuǎn)。由圖3-B 可知，福建野生茶樹資源的主要標(biāo)志物為表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），栽培品種含量較高的為表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）。如圖3-C 所示，共有4 種化合物的 VIP (Variable importance for the projection，VIP)值大于1，變量VIP 值由高至低依次是表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、兒茶素（C）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）和沒食子兒茶素（GC）。此外，VIP 大于1 的4 種化合物在因子載荷圖（圖3-B）中均屬于離兩類資源較近的變量。

圖3 43 份福建野生茶樹資源及8 個(gè)栽培品種兒茶素組分的OPLS-DA 分析Fig. 3 OPLS-DA statistical analysis on catechins in 43 wild tea germplasms in Fujian and 8 cultivated varieties

2.3 聚類熱圖可視化分析

為直觀展示兒茶素組分在福建野生茶樹資源及栽培品種間的差異，對(duì)所測數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類熱圖可視化分析，顏色偏向紅色說明含量越高。如圖4 所示，43 份福建野生茶樹資源中有12 份與栽培品種聚為A 類，以詔安和蕉城地區(qū)的種質(zhì)居多。其中，蕉城地區(qū)的3 份種質(zhì)的兒茶素組分含量與栽培品種最為接近，如圖中區(qū)域1 所示，其表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）和兒茶素（C）含量較高，而其他物質(zhì)含量均較低。B 類為剩余的31 份福建野生茶樹資源，其與栽培品種具有明顯的區(qū)分，如圖中區(qū)域2 所示，其表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基）沒食子酸酯（EGCG3″Me）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）含量較高。

圖4 43 份福建野生茶樹資源及8 個(gè)栽培品種兒茶素組分聚類熱圖可視化分析Fig. 4 Heatmap analysis on catechins in 43 wild tea germplasms in Fujian and 8 cultivated varieties

2.4 特異性福建野生茶樹資源篩選

根據(jù)兒茶素組分測定結(jié)果，參照王新超[21]的茶樹特異資源篩選指標(biāo)，從43 份福建野生茶樹資源中篩選出一批在兒茶素組分上比較特異的資源，包括18 份高兒茶素茶樹資源，9 份高EGCG 茶樹資源，8 份高EGCG3″Me 茶樹資源（表3），這些特異資源可以作為育種親本用于之后的育種研究。

表3 福建野生茶樹特異資源的篩選Table 3 Selection of tea germplasms from wild resources found in Fujian

3 討論與結(jié)論

兒茶素組分是茶樹次生物質(zhì)代謝產(chǎn)物的重要成分，對(duì)茶葉的色、香、味品質(zhì)的形成有重要作用[3]。鑒定茶樹種質(zhì)資源中的兒茶素組分含量及分布特征，對(duì)有針對(duì)性地開發(fā)利用資源具有重要意義。兒茶素組分又可劃分為酯型兒茶素與非酯型兒茶素（簡單兒茶素），其與茶葉滋味、茶葉保健功效密切相關(guān)。酯型兒茶素較非酯型兒茶素苦澀味更重，抗氧化效果更加突出[22]。本研究結(jié)果表明，在福建野生茶樹品種資源中，酯型兒茶素的含量均高于栽培品種，其中EGCG 和EGCG3″Me 含量極顯著高于栽培品種。此外，通過正交偏最小二乘判別分析及聚類熱圖分析發(fā)現(xiàn)，福建野生茶樹品種資源與栽培品種的主要差異物質(zhì)為EGCG 和EGCG3″Me，這與前人的研究結(jié)果相似[15,23]。從產(chǎn)區(qū)之間分析發(fā)現(xiàn)，蕉城地區(qū)與栽培品種聚為A 類，其EGCG3″Me、ECG、EGCG 均較低，但EGC 和EC 含量較高。尤溪湯川、安溪及漳平地區(qū)的茶樹品種資源聚為B 類，該類群各兒茶素組分含量均較高，特別是EGCG3″Me、ECG、EGCG 含量。而詔安、云霄及大田野生茶樹在A、B 兩類均有分布，不同茶樹種質(zhì)資源間兒茶素含量變化較大，無明顯區(qū)域特征。由此可見，福建野生茶樹品種資源富含豐富的EGCG 和EGCG3″Me，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

EGCG3″Me 是EGCG 甲基化產(chǎn)物，也是茶葉中最為常見的一種甲基化兒茶素，相比于EGCG，具有更強(qiáng)的抗氧化和抗衰老等保健功效[5]。茶葉中EGCG3″Me的含量因茶樹種質(zhì)的不同有很大差異，并且高含量EGCG3″Me 茶樹種質(zhì)資源的分布具有一定的區(qū)域性特征[24]。呂海鵬等[24]對(duì)國內(nèi)200 多份高茶多酚茶樹種質(zhì)展開調(diào)研，發(fā)現(xiàn)在福建、廣東兩地具有較多含有EGCG3″Me 的茶樹種質(zhì)。本研究中的43 份福建野生茶樹種質(zhì)資源中均檢測出EGCG3″Me，其中含量大于10 mg·g-1有24 份資源，大于20 mg·g-1有8 份資源，含量最高的為云霄6 號(hào)（33.65 mg·g-1）。隨著茶學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)入后基因組時(shí)代，茶樹次生物的代謝機(jī)理也逐漸深入到分子層面的研究階段[25-26]。但對(duì)于茶樹甲基化EGCG 形成機(jī)理的研究因缺少富含EGCG3″Me 的試驗(yàn)材料而嚴(yán)重受阻[13]，而此次篩選鑒定出富含EGCG3″Me 的種質(zhì)資源，將為茶樹高甲基化EGCG 形成機(jī)理研究以及發(fā)掘茶樹特異種質(zhì)資源提供試驗(yàn)材料。

福建野生茶樹種質(zhì)資源豐富，對(duì)其兒茶素組分構(gòu)成進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估，并從中篩選出高兒茶素茶樹資源（＞200 mg·g-1）18 份，高EGCG茶樹資源（＞150 mg·g-1）9 份，高EGCG3″Me茶樹資源（＞20 mg·g-1）8 份，為優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。