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    兩種抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料和成品中淋巴細(xì)胞毒效價(jià)檢測(cè)方法的相關(guān)性分析

    2022-06-23 01:58:34鄒浩勇薛紅剛殷文曲程文進(jìn)余健王智郭曉東張智
    中國生物制品學(xué)雜志 2022年6期
    關(guān)鍵詞:血漿檢測(cè)方法

    鄒浩勇,薛紅剛,殷文曲,程文進(jìn),余健,王智,郭曉東,張智

    武漢中生毓晉生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司,湖北 武漢 430207

    抗人 T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白(ALG / ATG)藥物是一種多抗生物治療抑制劑,其適應(yīng)癥較廣泛,主要用于再生障礙性貧血、器官移植、自身免疫系統(tǒng)疾病等的治療[1]。該產(chǎn)品主要通過收集大量由胸腺或T淋巴細(xì)胞免疫的各種動(dòng)物(馬、兔、豬或山羊)含特異性抗體的血漿,并進(jìn)行純化后制備[2],可通過多種途徑對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。ATG 通過破壞淋巴細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制作用,主要機(jī)制可能是通過激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,以及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用來清除體內(nèi)的T 細(xì)胞[3-7]。生物測(cè)定可直接評(píng)估生物活性產(chǎn)品的生物活性,是確保生物制品中藥物活性的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)[8]。

    《歐洲藥典》和《英國藥典》早已通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定ATG 產(chǎn)品的淋巴細(xì)胞毒效價(jià)[9-11],而《中國藥典》四部(2020 版)[12]仍采用傳統(tǒng)人工計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)的方法,其人為因素較多,結(jié)果差異也較大。因此,本研究借鑒《歐洲藥典》和《英國藥典》的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法,建立一種適合ATG 原料和成品中淋巴細(xì)胞毒效價(jià)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法,并與傳統(tǒng)人工計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)方法進(jìn)行相關(guān)性分析,以期為我國抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白產(chǎn)品質(zhì)量的提升奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 血漿及血液 免疫后豬血漿由本公司提供;人外周血由本公司人員捐獻(xiàn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)日本大耳白兔,3 ~ 4月齡,雌雄不限,體重2.0 ~ 2.5 kg,由本公司動(dòng)物室提供。動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(鄂)2018-0099。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對(duì)兔子進(jìn)行養(yǎng)殖和使用,且按照動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行(WIBP-AIIYJ2020001)。

    1.3 主要試劑 PI 試劑和PBS 由湖北賽維爾生物科技有限公司提供;胎牛血清購自美國GIBCO 公司;Hank’s 液購自武漢Procell 公司;淋巴細(xì)胞分離液購自福建三一造血技術(shù)有限公司豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品由本公司制備。

    1.4 樣品及溶液的制備

    1.4.1 供試品溶液的稀釋 將人外周血免疫后的豬血漿60 ℃加熱10 min,用生理鹽水稀釋至1 ∶500、1 ∶1 000 后待檢。

    1.4.2 陰性對(duì)照樣品 免疫前的豬血漿60 ℃加熱10 min,用生理鹽水稀釋10 倍后備用。

    1.4.3 陽性對(duì)照樣品 將人T 淋巴細(xì)胞免疫后的豬血漿60 ℃加熱10 min,用生理鹽水稀釋10 倍后備用。

    1.4.4 淋巴細(xì)胞懸液 取新鮮人外周血15 mL,用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血淋巴細(xì)胞,用含20%胎牛血清的 Hank’s 液稀釋為 5 × 106個(gè) / mL。

    1.4.5 兔補(bǔ)體 按照《中國藥典》規(guī)定,篩選用于檢測(cè)的兔補(bǔ)體,用生理鹽水稀釋5 倍后備用。

    1.4.6 PI 染色液 用含2%胎牛血清的PBS 將PI 稀釋至 5 μg / mL,2 ~ 8 ℃保存,3 h 內(nèi)使用。

    1.5 豬血漿中淋巴細(xì)胞毒效價(jià)的檢測(cè)

    1.5.1 《中國藥典》方法 采用《中國藥典》中的淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)方法。判定標(biāo)準(zhǔn):陽性對(duì)照組的淋巴細(xì)胞死亡率>20%,且陰性對(duì)照組的淋巴細(xì)胞死亡率 <10%,試驗(yàn)成立;試驗(yàn)組的淋巴細(xì)胞死亡率 <10%為陰性(-),10% ~ 20%為可疑(±),> 20%為陽性,其中 21% ~ 40%為(+),41% ~ 60%為(),61% ~ 80%為(),≥ 81%為()。

    1.5.2 流式細(xì)胞術(shù) 前期步驟均按照《中國藥典》方法,最后將臺(tái)盼藍(lán)染色換為PI 染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。取供試品陽性、陰性樣品溶液各0.05 mL,加入淋巴細(xì)胞懸液0.05 mL,37 ℃反應(yīng)1 h;加入稀釋好的兔補(bǔ)體0.05 mL,37 ℃反應(yīng)30 min;制冷離心機(jī) 800 × g 離心 8 min,棄上清,加入 200 μL PI 溶液,常溫下反應(yīng)10 min,立刻置于冰上,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(由第三方檢測(cè)公司湖北塞維爾生物技術(shù)有限公司,使用貝克曼CytoFLEX 檢測(cè))。判定標(biāo)準(zhǔn)同1.5 項(xiàng)。并與《中國藥典》方法進(jìn)行相關(guān)性分析。

    1.6 豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品中淋巴細(xì)胞毒效價(jià)的檢測(cè) 分別采用1.5 項(xiàng)中的兩種方法檢測(cè)3 批豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,分析兩種檢測(cè)方法之間以及同種檢測(cè)方法不同稀釋倍數(shù)之間結(jié)果的相關(guān)性。以相關(guān)系數(shù)(r)>0.5,P <0.05 為顯著相關(guān);r > 0.5,P < 0.01 為極顯著相關(guān)。

    2 結(jié) 果

    2.1 豬血漿中淋巴細(xì)胞毒效價(jià)的檢測(cè)

    2.1.1 《中國藥典》方法 檢測(cè)結(jié)果顯示,陽性對(duì)照細(xì)胞死亡率為42%,陰性對(duì)照細(xì)胞死亡率為1%,陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立。人外周血T 淋巴細(xì)胞免疫的17 份豬血漿樣品在500 倍稀釋時(shí)有8 份不合格,其中1 份為陰性,7 份為可疑,合格率為52.9%;1 000 倍稀釋時(shí)合格率更低,僅為17.6%,其中3 份合格,11 份可疑,3 份為陰性。見表1。

    表1《中國藥典》方法檢測(cè)豬血漿樣品淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Lymphocytotoxicity test of porcine plasma samplesby method in Chinese Pharmacopoeia

    2.1.2 流式細(xì)胞術(shù) 檢測(cè)結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組(10 倍稀釋)平均PI+低于10%,陽性對(duì)照組(10 倍稀釋)平均PI+為92.3%,二者均成立,見圖1 和表2。其中圖1E 的人外周血淋巴細(xì)胞對(duì)照不進(jìn)行PI染色。

    表2 陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of flow cytometry in positive and negative control groups

    圖1 流式細(xì)胞術(shù)分析陰性對(duì)照(A、B)、陽性對(duì)照(C、D)、人外周血淋巴細(xì)胞(E)Fig.1 Flow cytometry of negative controls(A,B),positive controls(C,D)and human peripheral blood lymphocytes(E)

    17 份豬血漿樣品在500 倍稀釋時(shí)合格率為100%,1 000 倍稀釋時(shí)有1 份不合格,合格率為94.1%,見表3。與2.1.1 項(xiàng)相比,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果的合格率遠(yuǎn)高于人工檢測(cè)結(jié)果。

    表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)豬血漿樣品淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Flow cytometry of lymphocytotoxicity of porcine plasma samples

    2.2 豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品中淋巴細(xì)胞毒效價(jià)的檢測(cè)

    檢測(cè)結(jié)果顯示,兩種方法檢測(cè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立,見表4;用《中國藥典》方法檢測(cè)3 批豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品的結(jié)果比流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果低,但兩種方法的趨勢(shì)一致,見表5。

    表4 兩種方法檢測(cè)豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品對(duì)照組結(jié)果Tab.4 Determination results of final product of porcine antihuman T lymphocyte immunoglobulin by two methods in control group

    表5 兩種方法檢測(cè)豬抗人T 淋巴細(xì)胞免疫球蛋白成品結(jié)果(%)Tab.5 Determination results of final product of porcine antihuman T lymphocyte immunoglobulin by two methods(%)

    2.3 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,兩種檢測(cè)方法之間以及同種檢測(cè)方法不同稀釋倍數(shù)之間結(jié)果均顯著相關(guān),其中500 倍稀釋極顯著相關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)不同稀釋倍數(shù)之間的r(0.919)明顯高于《中國藥典》方法(0.737),表明流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果差異性更小,結(jié)果更準(zhǔn)確,見表6。3 批成品不同稀釋倍數(shù)時(shí)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果r 為0.910,P 為0.000 7,表明兩種方法也極顯著相關(guān)。

    表6 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的皮爾遜相關(guān)性分析(r)Tab.6 Pearson correlation analysis of determination results by two methods(r)

    3 討 論

    流式細(xì)胞術(shù)是 20 世紀(jì) 70年代初發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù),集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體,是對(duì)快速直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞、生物顆粒或液體中的大分子物質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)、快速、定性、定量分析和分選的一種技術(shù)[13-15]。本研究主要采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn),結(jié)果顯示,簡易的流式細(xì)胞術(shù)與傳統(tǒng)的《中國藥典》方法檢測(cè)結(jié)果具有相關(guān)性,且流式細(xì)胞術(shù)的不同稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果之間的r 比《中國藥典》方法高,表明流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。同時(shí),采用兩種方法檢測(cè)成品的結(jié)果也顯示二者之間存在極顯著的相關(guān)性,表明該簡易流式細(xì)胞術(shù)可行。

    流式細(xì)胞術(shù)用儀器可分析4 500 個(gè)以上細(xì)胞,比人工計(jì)數(shù)(100 個(gè)細(xì)胞)高出40 倍以上。從概率上,流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、差異更?。欢斯び?jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞的死亡率,細(xì)胞占比太小,且存在觀察視野不同結(jié)果不同的情況,人為誤差較大。原料檢測(cè)合格率結(jié)果顯示,《中國藥典》檢測(cè)方法合格率較低,也間接證實(shí)了該結(jié)論。從風(fēng)險(xiǎn)和經(jīng)濟(jì)上分析,因原料的生產(chǎn)周期較長,生產(chǎn)成本也較高,檢測(cè)結(jié)果的誤差會(huì)對(duì)產(chǎn)品原料的生產(chǎn)造成不利影響,增加產(chǎn)品供應(yīng)商的風(fēng)險(xiǎn)和成本,從而間接造成產(chǎn)品原料的短缺。因此,本研究建立的簡易流式細(xì)胞術(shù)提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性,有利于產(chǎn)品原料的檢定,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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