磁珠法結(jié)合實時定量PCR 檢測新型冠狀病毒滅活疫苗中宿主細(xì)胞殘留DNA 的驗證及應(yīng)用

周艷萍 ，盧佳 ，李茜 ，林鳳杰 ，楊安納 ，孟勝利 ，王澤鋆 ，申碩

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430207；2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430207

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19，簡稱新冠）給公眾健康造成了嚴(yán)重威脅。目前，在無特效藥物用于治療新冠的情況下，盡快研發(fā)和生產(chǎn)安全有效的疫苗是防控疫情蔓延的重要措施。基于此，不同種類的新冠疫苗正在研發(fā)，包括滅活疫苗、載體疫苗、核酸疫苗、重組亞單位疫苗等。截至2021年7月19日，有184 個新冠疫苗進(jìn)入臨床前研究，其中有108 個進(jìn)入臨床試驗，其中有36 個進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗，基于Vero 細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行研究的滅活疫苗有10 個。武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司研制的新冠滅活疫苗采用Vero 細(xì)胞基質(zhì)，使用β 丙內(nèi)酯2 次滅活，后期工藝采用兩步柱層析，無核酸酶處理。以病毒的徹底滅活、無添加劑、高純度病毒顆粒和病毒蛋白為工藝路線研究原則，確保安全性和保護(hù)效力。在臨床前和臨床Ⅰ／ Ⅱ期研究中安全性和免疫原性良好，目前已進(jìn)入臨床Ⅲ期研究［1］。

對于許多基于細(xì)胞基質(zhì)的病毒性疫苗［2］來說，宿主細(xì)胞殘留 DNA（residual cell DNA，rcDNA）是一種潛在的風(fēng)險，主要是具有感染性和致瘤性［2-4］。為了保證生物制品的安全性，在生產(chǎn)過程中必須保證rcDNA 得到有效去除。WHO、《歐洲藥典》、美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、《中國藥典》三部（2020版）均對rcDNA 含量及片段大小做出了規(guī)定［4-12］。目前檢測rcDNA 含量的方法有斑點雜交法、閾值法、熒光染色法及qPCR 法［13］。熒光染色法的優(yōu)勢在于其易用性和低成本，對于含DNA 水平較高的樣品（如上游生物過程樣本）具有一定的實用性，但其靈敏度較低，最低檢測限僅為0.2 ng；閾值法檢測rcDNA的靈敏度達(dá)1 ～3 pg，但其成本相對較高，通量低，DNA 片段小于600 bp 無法檢出；雜交法的優(yōu)點為成本低，在印跡前將DNA 與不同大小的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品電泳可評估DNA 片段大小，缺點是耗時長，靈敏度較低［13-15］。與其他方法相比，qPCR 法具有簡單、快速、更加靈敏、能檢測含量較低的殘留DNA 等優(yōu)點［14-20］。為了評估新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）rcDNA含量，本實驗采用磁珠法提取宿主細(xì)胞DNA，結(jié)合qPCR 法建立適用于新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）rcDNA的檢測方法，并對方法進(jìn)行驗證及初步應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試品 新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液及過程樣品由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室提供，包括制造批號XG202004Z007的工藝過程樣品及該批次原液樣品202005Y009，以及其他批次的疫苗原液樣品202006Y014、202006-Y015、202006Y018、202009Y022、202009Y002BR。

1.2 主要試劑及儀器 宿主細(xì)胞殘留DNA 前處理試劑盒、Vero 殘留DNA-154 檢測試劑盒及Vero 殘留DNA 片段分析檢測試劑盒均購自湖州申科生物技術(shù)有限公司；無水乙醇和異丙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABI 7500 定量PCR 儀購自美國Thermo 公司；rDNApurifyHCD 前處理系統(tǒng)購自湖州申科生物技術(shù)有限公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 將Vero-154 檢測試劑盒中Vero 細(xì)胞 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品（30 ng ／ μL）用 DNA 稀釋液稀釋至 300、30、3、0.3、0.03、0.003、0.000 3 pg ／ μL。另取100 μL DNA 稀釋液作為陰性對照。

1.3.2 供試品rcDNA 提取 按試劑盒說明書，用rDNApurify HCD 前處理系統(tǒng)提取rcDNA。

1.4 qPCR 檢測 反應(yīng)體系為qPCR Reaction Buffer 17 μL，VeroPrimer&Probe MIX-154 3 μL，模板 10 μL，混勻后 500 × g 離心 5 s，放入 7500 定量 PCR 儀中。反應(yīng)條件為：90 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 個循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)分析 qPCR 運行結(jié)束后，在結(jié)果分析窗口自動設(shè)置閾值，在此條件下用標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）對 DNA 濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測樣品的Ct 值代入方程，計算其初始濃度。系統(tǒng)適用性及可接受標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)（R2）≥0.99；PCR 擴增效率 90% ～ 110%，質(zhì)控樣品回收率：50% ~ 150%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤30%。

Vero 細(xì)胞 DNA 殘留量（pg ／ μL）= 樣品測定平均值 ／10 μL × 稀釋倍數(shù) × DNA 洗脫體積 ／ 樣品體積

1.6 磁珠法結(jié)合qPCR 的驗證

1.6.1 線性和范圍 取6 個濃度的Vero 細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品（30、3、0.3、0.03、0.003、0.000 3 pg ／ μL）各10 μL 進(jìn)行 qPCR，重復(fù) 3 次。

1.6.2 專屬性 考慮到在研制試劑盒的過程中已對其他種類的細(xì)胞做過專屬性驗證，在此僅對含Vero 細(xì)胞DNA 及不含Vero 細(xì)胞DNA 的樣品進(jìn)行專屬性驗證。取新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液和DNA 樣品稀釋液各 100 μL，分別加入 30 pg Vero 細(xì)胞 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，提取 DNA 進(jìn)行 qPCR，重復(fù) 3 次，計算其回收率。同時取新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液和DNA 樣品稀釋液各 100 μL，提取DNA 進(jìn)行qPCR，重復(fù) 3 次。

樣品回收率（%）=（加標(biāo)樣品檢測平均值 - 樣品檢測平均值）／ 加入的 Vero DNA 的量 × 100%

1.6.3 準(zhǔn)確度 取DNA 稀釋液100 μL，分別加入30、3、0.3 pg Vero 細(xì)胞 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品，提取 DNA 進(jìn)行qPCR，重復(fù)3 次，并計算回收率。

1.6.4 精密度

1.6.4.1 重復(fù)性 取新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液2 批（202009Y022、202009Y002BR），加入 30 pg 標(biāo)準(zhǔn)品，抽提DNA 進(jìn)行qPCR，重復(fù)3 次，計算其RSD。同時取新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液100 μL，提取DNA 進(jìn)行 qPCR，重復(fù) 3 次。

1.6.4.2 中間精密度 由2 名試驗人員分別在不同時間取新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液2 批（2020-09Y022、202009Y002BR）100 μL，加入 30 pg 標(biāo)準(zhǔn)品，抽提DNA 進(jìn)行qPCR，重復(fù)3 次，計算RSD。同時取新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液 100 μL，抽提 DNA進(jìn)行qPCR。

1.7 方法的應(yīng)用 使用該方法對新冠滅活疫苗（Vero細(xì)胞）生產(chǎn)過程樣品（病毒收獲液、濃縮液、純化過程樣品、原液）進(jìn)行rcDNA 檢測。隨機選取3 批原液樣本，磁珠法提取DNA 檢測rcDNA，取回收率合格的樣品再次進(jìn)行片段大小檢測，按照試劑盒說明書，進(jìn)行qPCR 檢測。

2 結(jié) 果

2.1 方法的驗證

2.1.1 線性和范圍 磁珠法結(jié)合qPCR 檢測Vero細(xì)胞DNA 殘留量的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性結(jié)果見表1 和圖1。3 次試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均大于0.99，PCR 擴增效率分別為91.71%、94.34%和96.78%，均滿足要求，線性驗證結(jié)果符合接受標(biāo)準(zhǔn)。DNA 檢測范圍為 0.000 3 ~ 30 pg ／ μL。

圖1 線性和范圍驗證的擴增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Amplification and standard curves for linearity and range validation

表1 線性驗證結(jié)果Tab.1 Validation for linearity

2.1.2 專屬性 磁珠法qPCR 檢測新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液中Vero 細(xì)胞DNA 殘留量分別為0.51、0.47 和 0.45 pg ／ 10 μL，平均值為 0.48 pg ／10 μL。在疫苗原液中加入30 pg 的Vero 細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品后，回收率分別為61.98%、84.37%和74.00%。在 DNA 稀釋液中加入 30 pg 的 Vero 細(xì)胞 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品后，回收率分別為67.21%、63.96%和76.49%?；厥章示?0% ～150%范圍內(nèi)，符合接受標(biāo)準(zhǔn)。見表2。

表2 專屬性驗證結(jié)果Tab.2 Validation for specificity

2.1.3 準(zhǔn)確度 在100 μL DNA 稀釋液中加入30、3和0.3 pg Vero 細(xì)胞DNA 標(biāo)準(zhǔn)品后，平均回收率分別為69.22%、70.70%和107.99%，均在50% ~ 150%范圍內(nèi)，符合接受標(biāo)準(zhǔn)。見表3。

表3 準(zhǔn)確度驗證結(jié)果Tab.3 Validation for accuracy

2.1.4 精密度

2.1.4.1 重復(fù)性 2 批新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液（202009Y022、202009Y002BR）的 rcDNA 含量分別為 0.35 和 0.05 pg ／ 10 μL；加入 30 pg 標(biāo)準(zhǔn)品后，重復(fù)檢測3 次的RSD 分別為5.93%和6.65%，滿足RSD ≤30%的要求，符合接受標(biāo)準(zhǔn)。見表4。

表4 重復(fù)性驗證結(jié)果Tab.4 Validation for reproducibility

2.1.4.2 中間精密度 2 批新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）原液（202009Y022、202009Y002BR）Vero 細(xì)胞 DNA含量測定平均值分別為 0.54 和 0.06 pg ／ 10 μL；加入30 pg Vero 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品后，2 名測試人員在不同時間分別重復(fù)3 次，結(jié)果均符合接受標(biāo)準(zhǔn)。見表5。

表5 中間精密度驗證結(jié)果Tab.5 Validation for intermediate precision

2.2 方法的應(yīng)用 使用該方法對新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）生產(chǎn)過程樣品進(jìn)行rcDNA 檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2≥ 0.99，擴增效率為90% ～110%，擴增曲線光滑平穩(wěn)，峰值較高，且指數(shù)增長期、線性增長期及平臺期明顯，見圖2，符合定量檢測要求。純化前樣品Vero 細(xì)胞DNA 殘留量最高，經(jīng)一系列純化后，Vero 細(xì)胞 DNA 殘留量逐漸降低，低于 100 pg ／ 劑，見表6。3 批原液rcDNA 片段大小分布見表7，片段大于221 bp 的rcDNA 均未檢測到。

表6 疫苗生產(chǎn)過程中Vero 細(xì)胞DNA 殘留量的變化（pg／μL）Tab.6 Change of residual DNA content in Vero cells during vaccine production（pg ／ μL）

表7 3 批原液中DNA 片段大小分布情況（%）Tab.7 Size distribution of DNA fragments in three batches of bulk（%）

圖2 疫苗生產(chǎn)過程樣品rcDNA 檢測的擴增曲線（A）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.2 Amplification（A）and standard（B）curves for determination of rcDNA in samples during vaccine production

3 討 論

以傳代細(xì)胞系作為細(xì)胞基質(zhì)的生物制品，其rcDNA 具有潛在的安全風(fēng)險［6，13，21］。為了確保產(chǎn)品的安全性，廠家在產(chǎn)品開發(fā)過程中及藥物監(jiān)管均需確認(rèn)生產(chǎn)工藝中 rcDNA 的去除程度［6，13-14，16-17］。目前，由于Vero 細(xì)胞易培養(yǎng)、生長快、能進(jìn)行規(guī)?；牟《九囵B(yǎng)，人用滅活疫苗大多采用Vero 細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行研發(fā)及生產(chǎn)。幾十年來，rcDNA 潛在的致癌性和感染性仍是關(guān)注的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，Vero細(xì)胞具有致瘤性，外源性DNA 的插入會導(dǎo)致原癌基因的激活及抑癌基因的失活［22-23］。通過DNA 酶降解或化學(xué)滅活（如β-丙內(nèi)酯等）降低DNA 片段大小，rcDNA 的潛在風(fēng)險可大大降低［23］。另一方面，若病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組存在于rcDNA 中，將存在潛在感染風(fēng)險，當(dāng)這種DNA 作為疫苗的成分接種時，可能會導(dǎo)致致病性感染［24］。因此，需嚴(yán)格控制rcDNA 含量。近年來，由于qPCR 檢測rcDNA 更加快速、靈敏，qPCR 法逐漸應(yīng)用于rcDNA 含量的檢測，同時，qPCR 也可用于 rcDNA 片段大小的檢測［13-14］。另外，還有一些新方法用于rcDNA 含量檢測［25-27］?，F(xiàn)行《中國藥典》將qPCR 法加入rcDNA 含量的檢測，并規(guī)定 rcDNA 含量應(yīng)不高于 100 pg ／ 劑［12］。對于某些疫苗來說，rcDNA 含量不高于 10 pg ／ 劑［17］。許多基于Vero 細(xì)胞基質(zhì)的疫苗在原液階段rcDNA 含量不高于 100 pg ／ 劑［13］。

本研究使用磁珠法結(jié)合qPCR 對新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）中rcDNA 含量進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示，方法的線性、專屬性、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度等各項指標(biāo)均可達(dá)到方法驗證的要求，可用于新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）的rcDNA 含量測定。在原液階段，rcDNA 已大幅降低，在原液階段配置為臨床研究劑量后，其 rcDNA 含量小于 100 pg ／ 劑，片段大小小于200 bp，不足以編碼為一個功能蛋白。通過對20 批次新冠疫苗（Vero 細(xì)胞）樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其 rcDNA 含量均小于 100 pg ／ 劑（結(jié)果未呈現(xiàn)）。下一步將擴大驗證規(guī)模，并檢測其他以Vero 細(xì)胞為基質(zhì)的病毒類疫苗的rcDNA 水平，為其他以Vero細(xì)胞為細(xì)胞基質(zhì)的疫苗提供合理及客觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)。

本研究中的新冠滅活疫苗（Vero 細(xì)胞）在臨床Ⅰ／ Ⅱ期研究中安全性和免疫原性良好［1］。臨床Ⅲ期研究正在開展。疫苗質(zhì)量控制方法的建立、驗證和應(yīng)用，包括rcDNA 含量檢測方法的完善，對疫苗獲批上市后大規(guī)模生產(chǎn)、接種的持續(xù)質(zhì)量控制具有重要意義。