小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立及鑒定

馬玲玲 ，馬紅梅 ，朱源鶴 ，宋孚洋 ，史客松 ，馬臣杰 ，曾瑾

1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021

巨噬細(xì)胞于1882年由俄羅斯動物學(xué)家élieMetchnikoff 發(fā)現(xiàn)，從而開啟了先天免疫主要防御機(jī)制的相關(guān)研究，該發(fā)現(xiàn)于1908年被授于諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎［1］。巨噬細(xì)胞來源于血液單核細(xì)胞，單核細(xì)胞向組織遷移并分化，在整個組織中建立起防御病原體和體內(nèi)平衡的功能，在機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮重要作用，如抗原的加工及呈遞、凋亡細(xì)胞及入侵病原體的清除，細(xì)胞因子的分泌等。均質(zhì)的巨噬細(xì)胞群體在生命科學(xué)的相關(guān)研究中十分重要，因此，RAW264.7、J774A.1、THP-1、U937等傳代的巨噬細(xì)胞樣骨髓細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)相關(guān)研究中。但這些細(xì)胞系由于連續(xù)傳代培養(yǎng)所施加的選擇性壓力通常會導(dǎo)致一些基因的丟失，這些基因?qū)τ诩?xì)胞的增殖并不重要，但對于巨噬細(xì)胞免疫功能卻至關(guān)重要［2］，特別是使此類傳代細(xì)胞難以體現(xiàn)原代巨噬細(xì)胞真實(shí)的細(xì)胞生理活動。

為了更好地研究巨噬細(xì)胞被病原體感染后的免疫應(yīng)答反應(yīng)，往往使用原代細(xì)胞系，而且生命科學(xué)研究中轉(zhuǎn)基因小鼠和基因敲除小鼠的廣泛應(yīng)用，均迫切需要從這些動物中獲得原代細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。目前，原代小鼠巨噬細(xì)胞的3 個主要來源是腹腔巨噬細(xì)胞（peritoneal macrophage，PM）、肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage，AM）和骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）。腹腔巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的獲取相對容易，但產(chǎn)量低且巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特性易受動物飼喂環(huán)境衛(wèi)生條件的影響。BMDM 則是供體小鼠的骨髓干細(xì)胞在體外分化獲得的，基本不受供體小鼠的健康狀況影響，相對全面地保留基因表達(dá)譜且不受環(huán)境變化影響［3］。小鼠BMDM 是在巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）或小鼠成纖維細(xì)胞系（L929）上清等存在下，對未分化的骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外分化獲得的原代巨噬細(xì)胞，現(xiàn)已成為免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)重要的原代細(xì)胞模型。與許多其他原代細(xì)胞相比，小鼠BMDM 具有同質(zhì)性、一定的增殖能力和超過1 周的壽命。有研究表明，小鼠BMDM 生長至第3 周尚未出現(xiàn)明顯的死亡或形態(tài)改變［4］。該細(xì)胞易高產(chǎn)獲得，可冷凍儲存，也可從轉(zhuǎn)基因小鼠身上獲得，同時可從1 只小鼠中獲取大量BMDM，從而滿足平行實(shí)驗(yàn)的設(shè)置。因此，BMDM 所具有的優(yōu)勢使其在大多數(shù)免疫學(xué)研究中均傾向于選擇該種細(xì)胞作為典型巨噬細(xì)胞模型。

目前，有很多研究者對BMDM 進(jìn)行了研究。2015年，BARRETT 等［5］為了評估 BMDM 是否誘導(dǎo)了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，將混合的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物在條件培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，其中條件培養(yǎng)基是從未刺激的小鼠和老年大鼠的BMDM 中獲得的，并評估了炎癥標(biāo)記物的表達(dá)。2012年，MANZANERO［6］也用M-CSF 誘導(dǎo)骨髓原始細(xì)胞，成功制備了小鼠BMDM。2019年，LI 等［7］發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的 BMDM 中，MAPK、NF-kB 和 IRF3 通路均被激活。同年，OPPONG-NONTERAH 等［8］以 BMDM為巨噬細(xì)胞發(fā)育模型來測試早期炎癥信號是如何影響細(xì)胞分化和功能的，發(fā)現(xiàn)TLR 的激活改變了BMDM 的分化。2013年，TROUPLIN 等［9］也用 L929細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞，7 d 時間成功制備了 BMDM，并通過 F4 ／ 80 和 HLA-DR 標(biāo)記物及細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)證明小鼠骨髓細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。2018年，曾立等［10］在BMDM 向破骨細(xì)胞分化特性的研究中，用M-CSF 誘導(dǎo)骨髓原始細(xì)胞，并用CD11b 抗體對BMDM 表面抗原進(jìn)行鑒定，證實(shí)骨髓原始細(xì)胞經(jīng)M-CSF 刺激后所得的細(xì)胞是BMDM。最近的一項(xiàng)研究中，研究者利用BMDM 及TLR4 敲除的BMDM細(xì)胞系對于一種分離自卵黃的稱為“yolkin”的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，表明該蛋白可激活BMDM 細(xì)胞系產(chǎn)生包括TNF-α、Ⅰ型干擾素和NO 等先天性免疫介質(zhì)，并證實(shí)“yolkin”蛋白是以TLR4 依賴性的方式激活巨噬細(xì)胞的。該研究為證實(shí)卵黃可用作先天免疫的有效免疫刺激劑或常規(guī)免疫缺陷療法的補(bǔ)充劑提供了理論支持［11］。2019年，KIEFER 等［12］從血清類黏蛋白 1 樣蛋白 3（orosomucoid-like 3，ORMDL3）過表達(dá)小鼠中獲取BMDM，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠巨噬細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)基因小鼠模型BMDM 中的神經(jīng)酰胺含量顯著不同，但巨噬細(xì)胞的極化和吞噬能力未受ORMDL3表達(dá)水平的影響；該研究使用過表達(dá)的敲入小鼠模型BMDM 解決了ORMDL3 蛋白參與巨噬細(xì)胞生理的研究問題，為ORMDL3 表達(dá)與炎性疾病之間的功能聯(lián)系提供了新的見解。上述研究均表明，BMDM的成功分離配合基因編輯小鼠的應(yīng)用，在未來涉及免疫相關(guān)研究中的作用將越來越重要。

本研究旨在建立小鼠BMDM 培養(yǎng)模型，并進(jìn)行鑒定，旨在為研究免疫細(xì)胞功能、病原微生物與巨噬細(xì)胞相互作用提供理想的細(xì)胞模型制備方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及菌株 小鼠成纖維細(xì)胞NCTC clone 929（ATCC?CCL-1TM，L929）細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫 ／ 干細(xì)胞庫；表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的重組菌株 E.coli BL21（DE3）（pET30a-GFP）為作者構(gòu)建并保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級 C57BL-6J 小鼠，雌性，6 ~ 9周齡，體重18 ~ 20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。本實(shí)驗(yàn)對小鼠的處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.3 主要試劑 MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；M-CSF 和FITC 標(biāo)記的CD11b 抗體購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；小鼠M-CSF ELISA 試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.4 L929 細(xì)胞的培養(yǎng)及培養(yǎng)上清中M-CSF 含量的檢測 用含10%胎牛血清的MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2條件下傳代培養(yǎng) L929 細(xì)胞，細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，傳至173 mm2透氣培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，一組置于32 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，另一組置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用0.22 μm濾器過濾去除細(xì)胞碎片，分裝后于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。按照小鼠M-CSF ELISA 試劑盒說明書檢測不同培養(yǎng)溫度條件下L929 細(xì)胞上清中M-CSF 含量。

1.5 小鼠BMDM 的制備 乙醚麻醉處死小鼠，在75%乙醇中浸泡2 min 鐘；用無菌手術(shù)剪剝除小鼠腿部皮膚，剪取小鼠股骨及脛骨，刮除骨上的肌肉及筋膜，用含2%青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液漂洗骨表面；剪除股骨及脛骨兩端，吸取5 mL DMEM 培養(yǎng)基，將注射器針頭插入股骨及脛骨骨髓腔，吹出骨髓，重復(fù)多次，直至股骨及脛骨無色，吹散后收集單細(xì)胞懸液，離心，棄上清；在離心細(xì)胞沉淀中加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液，迅速吹散細(xì)胞沉淀，20 s 后加入10 mL 含10 %胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中和，離心棄上清；加入完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，接種至細(xì)菌培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；輕輕搖動培養(yǎng)皿，吸取未貼壁細(xì)胞，離心棄上清，細(xì)胞沉淀重懸后，重新接種于含20 ng ／ mL M-CSF 或20% L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清的完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記為第1 天；第3 天時對細(xì)胞進(jìn)行半量換液，此后隔天換液至第7 天，獲得小鼠BMDM。培養(yǎng)過程中通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁生長情況。

1.6 小鼠BMDM 表面標(biāo)志物抗原的鑒定

1.6.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測 取誘導(dǎo)分化7 d 后的小鼠BMDM，加入胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，加入PBS 50 μL 重懸細(xì)胞并調(diào)整至每管1×106個。細(xì)胞中加入0.5 μL FITC 標(biāo)記的CD11b，避光室溫孵育30 min；洗滌重懸，設(shè)置入射波長為488 nm，發(fā)射波長530 nm。吸取細(xì)胞懸液，300 目尼龍膜雙層過濾至上樣管，輕搖使細(xì)胞均勻分布。以不染色的空白組為對照，調(diào)整細(xì)胞群后，對染色細(xì)胞進(jìn)行流式檢測。

1.6.2 免疫熒光檢測 取誘導(dǎo)分化7 d 后的小鼠BMDM，制備細(xì)胞爬片，加入4%多聚甲醛固定、封閉，加入 FITC 標(biāo)記的CD11b 和 Texas red 標(biāo)記 CD16 抗體，4 ℃避光孵育，DAPI 染色后，熒光顯微鏡觀察。

1.7 小鼠BMDM 吞噬能力的鑒定 將E.coli BL21（DE3）（pET30a-GFP）劃線接種于 LB 固體平板（含100 μg ／mL Kan），倒置過夜，挑單菌落于 10 mL LB 液體培養(yǎng)基（含 100 μg ／ mL Kan）中，1 mmol ／ L IPTG 37 ℃常規(guī)誘導(dǎo)3 h，取1 mL 菌液，離心收集菌體沉淀，加入PBS 洗滌后，用PBS 調(diào)整菌體密度為108CFU／mL，進(jìn)行小鼠BMDM 吞噬能力檢測：在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d后的小鼠BMDM 中加入經(jīng)誘導(dǎo)后的E.coli BL21（DE3）（pET30a-GFP），感染復(fù)數(shù)為 1∶10，置 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h，熒光顯微鏡下觀察吞噬效果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)（雙尾法），以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)溫度條件下L929 細(xì)胞上清中M-CSF的含量 L929 細(xì)胞分別于32 ℃培養(yǎng)10 d 和37 ℃培養(yǎng)3 d，細(xì)胞培養(yǎng)上清清澈無細(xì)胞漂浮物，顏色為粉紅色；L929 細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)超過4 d 后，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞漂浮物，因此選取32 ℃培養(yǎng)10 d 和37 ℃培養(yǎng)3 d 的L929 細(xì)胞上清作為小鼠BMDM 的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。ELISA 檢測結(jié)果顯示，32 ℃培養(yǎng)10 d 的L929細(xì)胞上清中 M-CSF 的濃度［（44.14 ± 8.75）pg ／ mL］顯著高于 37 ℃培養(yǎng) 3 d［（4.383 ± 0.73）pg ／ mL］，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 11.09，P < 0.05）。

2.2 小鼠BMDM 的制備 顯微鏡觀察顯示，M-CSF和L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清均能有效誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)7 d 誘導(dǎo)處理后，細(xì)胞呈現(xiàn)多角形，形態(tài)均一，生長旺盛；相比于M-CSF，經(jīng)32 ℃培養(yǎng)10 d 的L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清處理后的細(xì)胞生長密度更大，且形態(tài)更均一。見圖1。

圖1 M-CSF（A）和L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清（B）誘導(dǎo)分化小鼠BMDM 的比較（× 200）Fig.1 Differentiation of mouse BMDMs induced by M-CSF（A）and L929 cell culture supernatant（B）（× 200）

32 ℃培養(yǎng)10 d 的L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化的能力更佳，尤其在誘導(dǎo)7 d 后，BMDM 生長旺盛，密度更大，形態(tài)更均一，狀態(tài)更佳，見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)條件L929 細(xì)胞上清誘導(dǎo)分化小鼠BMDM的比較（× 200）Fig.2 Differentiation of mouse BMDMs induced by L929 cell supernatant cultured under various condtions（× 200）

2.3 小鼠BMDM 表面標(biāo)志物抗原的鑒定

2.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測 檢測結(jié)果表明，小鼠BMDM CD11b 陽性率為80.62%，符合巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物特性，見圖3。

圖3 小鼠BMDM CD11b 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.3 Flow cytometry of CD11b on mouse BMDMs

2.3.2 免疫熒光檢測 熒光顯微鏡觀察顯示，經(jīng)誘導(dǎo)分化的小鼠BMDM 均呈現(xiàn)FITC 所標(biāo)記的綠色和Texas red 所標(biāo)記的紅色，表明經(jīng)誘導(dǎo)分化后，BMDM表面具有巨噬細(xì)胞標(biāo)志性抗原CD11b 和CD16，見圖4。

圖4 小鼠BMDM 的免疫熒光顯微鏡觀察（× 200）Fig.4 IFA of mouse BMDMs（× 200）

2.4 小鼠BMDM 的吞噬能力 熒光顯微鏡下觀察顯示，大量巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，表明表達(dá)綠色熒光的大腸埃希菌被巨噬細(xì)胞所吞噬，制備的小鼠BMDM 細(xì)胞具有吞噬能力，見圖5。

圖5 熒光顯微鏡觀察小鼠BMDM 的吞噬能力Fig.5 Microscopy of phagocytosis ability of mouse BMDMs

3 討 論

單核細(xì)胞由骨髓干細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生，并遷移至外周血和各種組織中分化為巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要組成部分，由于其強(qiáng)大的殺菌活性，成為抵御外來入侵的第一道防線。巨噬細(xì)胞吞噬微生物后，將其在溶酶體中降解，并向其他免疫細(xì)胞（如T 淋巴細(xì)胞）發(fā)送招募信號并呈遞抗原。巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身，并大量存在于淋巴器官、肝、肺、胃腸道、骨骼和皮膚中，參與廣泛的生理和病理過程。過去10年的研究表明，細(xì)胞來源和在組織中的定位不同，巨噬細(xì)胞在本質(zhì)上也有所不同［13］。因此，從組織中大量獲取原代具有典型巨噬細(xì)胞特征的同質(zhì)細(xì)胞對真實(shí)反映吞噬細(xì)胞的生理特性更為重要。目前，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的是小鼠（RAW264.7 細(xì)胞）和人（PMA 分化的 THP-1 細(xì)胞）的巨噬細(xì)胞系，但它們具有細(xì)胞系模型固有的缺點(diǎn)，包括永生化以及基因表達(dá)譜不理想等問題。BMDM為一種易獲得的大量具有多種巨噬細(xì)胞特性的同質(zhì)細(xì)胞，其與體內(nèi)的常駐巨噬細(xì)胞具有相似性，相關(guān)的免疫應(yīng)答也與在各種病理生理環(huán)境中觀察到的情況相似，因此被廣泛用作體外研究的典型巨噬細(xì)胞［14-15］。此外，BMDM 是了解活化巨噬細(xì)胞極化機(jī)制的理想體外模型。如LPS 的刺激可誘導(dǎo)M1 巨噬細(xì)胞的活化，而IL-4 和IL-13 可誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞的極化，不同藥物或誘導(dǎo)因子可調(diào)節(jié)BMDM 向M1和M2 亞型極化［16-17］。通過流式細(xì)胞術(shù)分析表面抗原的表達(dá)，可識別出成熟的BMDM 和活化的巨噬細(xì)胞，包括 CD11b、F4 ／80、CD11c、CD206、CD69、CD80、CD16 和 CD17。

小鼠BMDM 是用適當(dāng)?shù)纳L因子在體外誘導(dǎo)分化小鼠骨髓中的前體細(xì)胞，并經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)獲得的，主要是利用M-CSF 或L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行誘導(dǎo)。M-CSF 通常為商品化購買獲得，其對小鼠骨髓前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化能力受品質(zhì)以及濃度的影響，往往需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定M-CSF 的最適濃度；L929 細(xì)胞株于 1948年分離自 100日齡雄性 C3H ／ An 小鼠的正常皮下結(jié)締組織中，并經(jīng)親本菌株傳代95 代后所穩(wěn)定獲得的細(xì)胞系，常用來進(jìn)行病原微生物的毒性測試，該細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)系統(tǒng)為含10%馬血清的MEM 培養(yǎng)基［18］。本實(shí)驗(yàn)為了避免后期使用L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞分化時馬血清對BMDM 細(xì)胞的影響，采用了含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)證明，L929 細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中富含較高活性的M-CSF，因此，成功用于對小鼠骨髓前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中。L929細(xì)胞培養(yǎng)上清成分除M-CSF 外，還含有其他多種細(xì)胞因子，如高濃度的 VEGF、MCP-1、KC、MIG 和低濃度的FGF-β、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子、IL-9、IL-10、IL-12 等［19-20］，推測這些細(xì)胞因子對小鼠骨髓源細(xì)胞的誘導(dǎo)起到一定的輔助作用。但以往文獻(xiàn)中均顯示［19-20］，用于誘導(dǎo) BMDM 的 L929 細(xì)胞上清是將L929 細(xì)胞于37 ℃培養(yǎng)3 ～5 d 后收獲的。本實(shí)驗(yàn)對L929 細(xì)胞的培養(yǎng)條件和小鼠BMDM 誘導(dǎo)分化環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化，將L929 細(xì)胞分別于37 ℃培養(yǎng)3 d和32 ℃培養(yǎng)10 d，分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，用于制備BMDM，結(jié)果顯示，32 ℃培養(yǎng)10 d 所收集的L929細(xì)胞培養(yǎng)上清可更高效地誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞分化為BMDM，細(xì)胞生長旺盛，密度更高，形態(tài)更均一。分析原因，可能是由于L929 細(xì)胞在低于常規(guī)溫度的培養(yǎng)條件下新陳代謝緩慢，對培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的攝取較低，可耐受長達(dá)10 d 的培養(yǎng)，并在較長的培養(yǎng)時間內(nèi)積累了較多的M-CSF，且產(chǎn)生的代謝廢物較少。本實(shí)驗(yàn)對兩種溫度條件下培養(yǎng)的L929 細(xì)胞上清中的M-CSF 進(jìn)行了檢測，結(jié)果也證實(shí)，32 ℃培養(yǎng)條件下的L929 細(xì)胞積累了濃度更高的M-CSF。因此，L929 細(xì)胞培養(yǎng)上清作為小鼠骨髓前體細(xì)胞的誘導(dǎo)劑能使BMDM 生長迅速，細(xì)胞形態(tài)均一，相比于M-CSF 更易控制誘導(dǎo)的濃度，也具有價格上的優(yōu)勢。而且，本研究推薦采用32 ℃條件下培養(yǎng)10 d 后收集的L929 細(xì)胞上清作為BMDM 的誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基。在小鼠BMDM 的表面標(biāo)志抗原鑒定試驗(yàn)中，我們使用了CD11b 標(biāo)記后的流式細(xì)胞術(shù)檢測以及CD11b、CD16 標(biāo)記后的免疫熒光檢測兩種方法。結(jié)果顯示，經(jīng)L929 培養(yǎng)上清誘導(dǎo)獲得的BMDM 均檢測到巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志抗原的表達(dá)。在小鼠BMDM的吞噬能力鑒定中，本實(shí)驗(yàn)也采用了本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的表達(dá)綠色熒光的大腸埃希菌作為吞噬材料進(jìn)行檢測，其比傳統(tǒng)的雞紅細(xì)胞具有材料易得、制備簡單的優(yōu)勢，且比熒光微球價格低廉。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用在32 ℃條件下培養(yǎng)10 d的L929 細(xì)胞上清誘導(dǎo)分化小鼠骨髓前體細(xì)胞，成功制備了小鼠BMDM，為研究免疫細(xì)胞功能、病原微生物與巨噬細(xì)胞相互作用提供了理想的細(xì)胞模型制備方法。