纖維蛋白原國家標準品的研制

孫楠，于婷，張文新，孫晶，胡澤斌，高飛，曲守方，黃杰

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

纖維蛋白原（fibfinogen，F(xiàn)ib）即凝血因子Ⅰ，是血漿中含量最高的一種凝血蛋白，是凝血系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)。Fib 在凝血過程最后階段由凝血酶轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，最終形成不溶性纖維蛋白凝塊，從而發(fā)揮血液凝固作用［1］。健康人血漿中Fib 含量的參考值為2.0 ~ 4.0 mg ／ mL，超過該范圍時，表明凝血功能異常。Fib 水平增高（＞ 4 mg ／ mL）常見于糖尿病、急性傳染病、腎病綜合征、妊高癥、心腦血管疾病、惡性腫瘤、炎癥應(yīng)激反應(yīng)、肥胖癥［2-5］；Fib 水平降低（＜ 2 mg ／ mL）常見于彌漫性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎、肝功能嚴重障礙或先天性缺乏［6-8］，低于 1.5 mg ／ mL 時，機體發(fā)生出血的概率明顯增加［9］。

WHO 于1992年建立了第1 個血漿Fib 國際標準品［10］，編號：89 ／ 644，取值 2.4 mg ／ mL。該標準品得到普及和應(yīng)用，但該標準品在復溶時有些渾濁，長期存放后尤為明顯；WHO 于1999年建立了第 2 個血漿 Fib 國際標準品［11］，編號：98 ／ 612，取值2.2 mg ／安瓿，代替了第 1 個標準品；WHO 于 2014年建立了第 3 個血漿 Fib 國際標準品［12］，編號：09 ／264，取值2.7 mg ／ 安瓿。但國際標準物質(zhì)購買周期長，且費用較高。目前，我國尚無人血漿Fib 標準物質(zhì)。因此，本實驗進行首批血漿Fib 國家標準品的研制，以期改善該標準物質(zhì)匱乏的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 原料 血漿（枸櫞酸鈉抗凝）由北京賽科希德科技股份有限公司提供。

1.2 國際標準品 第3 批人血漿Fib 國際標準品（NIBSC 批號：09 ／ 264，取值 2.7 mg ／ 支）由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.3 主要試劑 Fib 測定試劑盒（凝固法）分別由北京九強生物技術(shù)股份有限公司、希森美康生物科技（無錫）有限公司、廣州萬孚生物技術(shù)有限公司、北京賽科希德科技股份有限公司、沃芬醫(yī)療器械商貿(mào)（北京）有限公司及邁克生物股份有限公司提供；Fib 測定試劑盒（液體）由邁瑞集團長島生物技術(shù)有限公司提供；Fib 測定試劑盒（散射比濁法）由西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品（上海）有限公司提供；梅特勒卡爾費休水分滴定儀由北京利德曼生化股份有限公司提供；全自動凝血分析儀（型號：maccura H-04）由邁克生物股份有限公司提供；全自動凝血分析儀（型號：TECO Coatron 3000）由北京九強生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.4 國家標準品的制備 用冷沉淀法從血漿中獲得Fib 沉淀［13］，采用北京賽科希德科技股份有限公司的Fib 測定試劑盒（凝固法）測定沉淀和上清血漿中Fib 含量，將Fib 沉淀與Fib 含量較低的原料血漿混合，配制成 Fib 含量為 4、2、0.75 mg ／ mL 的定值血漿（水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。按 0.5 mL ／ 安瓿進行分裝，委托基蛋生物科技股份有限公司凍干和融封，即為Fib 國家標準品。

1.5 水分測定 隨機抽取水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Fib 國家標準品各 3 支，按《中國藥典》三部（2020 版）［14］規(guī)定，采用庫倫滴定法進行水分測定［15］，凍干品的殘水量應(yīng)＜5%。

1.6 均勻性檢驗 隨機抽取水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Fib 國家標準品各10 支，參照CNAS-GL03《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》［16］，采用maccura H-04型全自動凝血分析儀檢測標準品的均勻性，每支重復檢測2 次。對檢測結(jié)果進行單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。并以Fib 國際標準品為對照，對國家標準品與對照的效價比值（Pt）進行變異系數(shù)分析。

1.7 穩(wěn)定性檢驗 隨機抽取水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的Fib 國家標準品各 14 支，分別于 20 ～ 25 及 2 ～ 8 ℃放置14 和 28 d，37 ℃放置 7、14 和 28 d。水平Ⅰ、Ⅱ使用TECO Coatron 3000 全自動凝血分析儀進行測定，水平Ⅲ使用maccura H-04 凝血分析儀進行測定。以-20 ℃保存的Fib 國家標準品為對照，以各儲存條件下國家標準品與對照的Pt 評價標準品的穩(wěn)定性。

1.8 協(xié)作標定 以Fib 國際標準品為對照，對Fib國家標準品（水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）進行協(xié)作標定。選取9 家實驗室（編號：1 ～ 9），其中 6 家實驗室采用凝固法，3 家實驗室采用比濁法，按各試劑盒說明書進行檢測，檢測結(jié)果采用log-Logit 數(shù)學模型進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 水分 水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ Fib 國家標準品的水分均值分別為4.2%、4.8%、4.3%，均＜5%。

2.2 均勻性 水平Ⅰ、Ⅱ、ⅢFib 國家標準品的F 均＜Fcrit，P 均 ＞ 0.05，見表1。水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ國際標準品的相關(guān)系數(shù)分別為-0.999 2、-0.999 2、-0.998 2。10份水平Ⅰ、Ⅱ、ⅢFib 國家標準品的變異系數(shù)分別為4.64%、4.38%、4.49%，均 ＜5.0%，見表2。上述結(jié)果表明，制備的Fib 國家標準品具有良好的均勻性。

表1 均勻性檢測結(jié)果的單因素方差分析Tab.1 One way ANOVA of test results of uniformity

表2 均勻性Pt 的變異系數(shù)分析Tab.2 Analysis of coefficients of variation of Pt in uniformity test

2.3 穩(wěn)定性 水平Ⅰ的Fib 國家標準品于2 ～8 及20 ～ 25 ℃條件下保存 28 d 內(nèi)，Pt 在 0.960 5 ～ 1.018 0之間，37 ℃保存 14 d，Pt 為 0.950 0 和 0.949 4，穩(wěn)定性均良好。水平Ⅱ的Fib 國家標準品于2 ～8 及20 ～ 25 ℃條件下保存 28 d 內(nèi)，Pt 在 0.952 7 ～ 1.069 4之間，穩(wěn)定性良好；37 ℃保存時不穩(wěn)定。水平Ⅲ的Fib國家標準品于2 ～ 8 ℃保存 28 d、20 ～ 25 ℃保存 14 d、37 ℃保存 7 d 時，Pt 在 0.983 7 ～ 1.027 9 之間，穩(wěn)定性良好。見表3。

表3 穩(wěn)定性Pt 的測定結(jié)果Tab.3 Test results of Pt in stability test

2.4 協(xié)作標定 經(jīng)9 個實驗室的協(xié)作標定，水平Ⅰ、Ⅱ、ⅢFib 國家標準品蛋白含量分別定值為：3.7、1.4、0.75 mg ／ mL，見表 4。

表4 Fib 國家參考品協(xié)作標定結(jié)果Tab.4 Collaborative calibration of national standard for Fib

3 討 論

Fib 的參考區(qū)間為 2.0 ～ 4.0 mg ／ mL，本研究將制備的Fib 國家標準品設(shè)置了3 個濃度水平，水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別為參考區(qū)間上限、參考區(qū)間下限和醫(yī)學決定水平檢測限。為便于獲得參考范圍以外異常低值和高值濃度的標準品，本研究采用冷沉淀法制備Fib國家標準品，從血漿中分離提取Fib，再將其加入至正常血漿中，配制成不同濃度水平的國家標準品。

Fib 檢測方法較多，其中酚試劑比色法（jocobsson法）為WHO 推薦的參考方法，第1 個國際標準品是采用該方法定值的，但由于該方法需手工操作，導致國際標準品的精密度較差。隨著自動化凝血分析儀的出現(xiàn)和逐漸普及，目前市售的凝固法Fib 檢測試劑已有10 多種，也是WHO 和CLSI 推薦的常規(guī)測定方法。WHO 建立的第2 個和第3 個Fib 國際標準品是采用該方法定值的。本研究制備的國家標準品也是采用凝固法來定值的。經(jīng)協(xié)作標定，由于部分試劑盒檢測水平Ⅰ的結(jié)果差異較大，未納入本次定值，分析原因可能是Fib 濃度高時反應(yīng)凝固快，不易檢測準確；Fib 的醫(yī)學決定水平濃度較低，為使低水平測試更準確，犧牲了高值的準確性；WHO 標準品的濃度為2.7 ng ／ mL，濃度偏低，即使溯源至WHO標準品，較難確保高值的準確性。另外，免疫比濁法檢測試劑盒檢測水平Ⅰ的結(jié)果偏差較大。因此，不對水平Ⅰ測定值做要求，僅供參考。

綜上所述，本實驗室成功建立了Fib 國家標準品，包括3 個濃度水平，水平Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蛋白濃度分別定值為 3.7、1.4、0.75 mg ／ mL，該標準品具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，可用于Fib 凝固法和比濁法試劑盒的準確性評價。