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    芍藥苷對(duì)1-甲基-4-苯基-吡啶離子誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制

    2022-06-23 01:58:30陳明惠鄭梅竹周密王文麗梁美幀劉麗麗嚴(yán)苗藝
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    陳明惠,鄭梅竹,周密,王文麗,梁美幀,劉麗麗,嚴(yán)苗藝

    1.長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130032;2.長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130032

    帕金森病(Parkinson disease,PD)是一種以黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元選擇性和進(jìn)行性退化,紋狀體中多巴胺水平降低為主要特征的一種神經(jīng)退行性疾病,嚴(yán)重影響人類健康[1-2]。目前,PD 確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確,但氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是急性和慢性神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元死亡的主要原因[3-5]。因此,抑制多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡或通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)控制細(xì)胞凋亡成為預(yù)防和治療PD 的新策略。目前治療PD 的藥物多為合成藥物,毒副作用較大,在治療上有一定的局限性,因此開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒、副作用小的天然抗PD 藥物具有重要意義。

    芍藥苷(peoniflorin,PF)是從中國(guó)傳統(tǒng)草藥白芍中分離出的單萜糖苷,具有廣泛的藥理作用,目前主要用于治療大腦局部供血不足[6]、羊癲瘋(癲癇)[7]及中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰弱性疾?。ㄈ绨柎暮D。?]和 PD[9])等。有研究表明,PF 對(duì)學(xué)習(xí)和記憶、鎮(zhèn)痛和抗氧化方面均有顯著作用[10-12]。有報(bào)道表明,PF可能通過(guò)激活腺苷A1 受體,改善神經(jīng)遞質(zhì)功能,調(diào)節(jié)離子通道穩(wěn)態(tài),延緩氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)而發(fā)揮保護(hù)作用[13-15],但目前PF 抗PD活性的作用機(jī)制尚未明確。1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)是一種神經(jīng)毒素,有研究表明,MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是在體外研究多巴胺能變性疾病的主要模型[16]。PC12 細(xì)胞是一種大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株,具有許多人類神經(jīng)元的顯著特征,是目前研究神經(jīng)疾病的主要細(xì)胞模型。本研究采用MPP+誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型,模擬PD 患者腦神經(jīng)元損傷狀態(tài),探討PF 對(duì)MPP+誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用在細(xì)胞水平的作用機(jī)理,為將PF 作為治療PD 新藥的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞 PC12 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

    1.2 主要試劑 PF 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;MPP+購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自吉林一向生物科技有限公司;美多芭購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司;MTT 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測(cè)試劑盒、Fura-3 / AM 試劑盒及 Caspase-3 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物公司;線粒體膜電位檢測(cè)熒光染料JC-1 及細(xì)胞蛋白裂解抽提試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;兔抗 Bax、Bcl-2、GAPDH 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司;HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12 細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖 DMEM,于 37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)至貼壁約80%時(shí),用0.25%胰酶消化,按1 ∶2 的比例傳代。

    1.4 PF 對(duì)PC12 細(xì)胞損傷作用的檢測(cè) 取第4 代PC12 細(xì)胞,按 5 × 103~ 8 × 103個(gè) / 孔加入 96 孔板,于 37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h;分別加入 0、25、50、100、200 μmol/L PF,100 μL /孔,繼續(xù)培養(yǎng) 48 h;加入 MTT,100 μL / 孔,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h;棄上清,加入DMSO,100 μL / 孔,用酶標(biāo)儀檢測(cè) A490。

    1.5 細(xì)胞分組及給藥 按1.4 項(xiàng)方法將PC12 細(xì)胞接種至96 孔板,培養(yǎng)24 h。分為正常對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng),不給藥)、MPP+損傷組(加入MPP+至終濃度為500 μmol / L)、陽(yáng)性對(duì)照組(加入 MPP+至終濃度為500 μmol / L 和美多芭至終濃度為 50 μg / mL)、藥物保護(hù)組(加入 MPP+至終濃度為 500 μmol / L 和 25、50 和 100 μmol / L 濃度的 PF)。均于 37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

    1.6 各組細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)觀察 各組細(xì)胞于倒置相差顯微鏡下,觀察并照相。

    1.7 各組細(xì)胞活性的檢測(cè) 于各組細(xì)胞中加入0.5 mg / mL 的 MTT,100 μL / 孔,于 37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h;棄上清,加入 DMSO,100 μL / 孔,用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490。

    1.8 各組細(xì)胞LDH 釋放量的測(cè)定 采用LDH 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中的LDH 釋放量,按說(shuō)明書(shū)操作,用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490,并按下式計(jì)算LDH 釋放率。

    LDH 釋放率(%)= LDH 釋放量 /(LDH 釋放量 + 未釋放的LDH 含量)× 100%

    1.9 各組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的檢測(cè) 采用Fura-3 / AM試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞中的Ca2+濃度,按說(shuō)明書(shū)操作后,于37 ℃培養(yǎng)45 min,熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

    1.10 各組細(xì)胞周期的檢測(cè) 取各組細(xì)胞,200×g 離心 5 min,收集細(xì)胞,PBS 緩沖液洗滌 3 ~ 4 次,用預(yù)冷的70%乙醇重懸細(xì)胞,加入200 μL 碘化丙啶(PI)和 RNase 混合物(終濃度分別為 50 和 100 μg / mL),于4 ℃遮光培養(yǎng)30 min;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,Cytometer 軟件分析結(jié)果。

    1.11 各組細(xì)胞中Caspase-3 活性的檢測(cè) 用Caspase-3檢測(cè)試劑盒中的裂解液充分裂解細(xì)胞,取上清液,與含緩沖液的Caspase-3 反應(yīng)底物Ac-LEHD-pNA 和Ac-DEVD-pNA 混勻,用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)pNA 的最佳釋放量,波長(zhǎng)為405 nm。

    1.12 各組細(xì)胞線粒體膜電位水平的檢測(cè) 各組細(xì)胞加入 5 μg /mL 的 JC-1,37 ℃避光孵育 20 min;PBS洗滌2 次。采用多功能細(xì)胞讀板器進(jìn)行檢測(cè),JC-1聚集體的激發(fā)波長(zhǎng)為525 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為590 nm;JC-1 單體的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為515 nm,以聚集體與單體熒光強(qiáng)度相對(duì)比例衡量線粒體膜電位。

    1.13 各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)用細(xì)胞蛋白裂解抽提試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,蛋白質(zhì)定量法測(cè)定蛋白的濃度。取30 μg 蛋白,經(jīng)10%SDS-PAGE 分離后,轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h;分別加入兔抗 Bcl-2、Bax(1 ∶1 000稀釋)及 GAPDH 單克隆抗體(1 ∶10 000 稀釋),于 4 ℃培養(yǎng)過(guò)夜;TBST 洗滌 5 ~ 6 次,每次 5 ~ 10 min,加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1 ∶1 000 稀釋),室溫培養(yǎng)45 min;TBST 洗滌 3 ~ 4 次,ECL 顯色。

    1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間比較采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn),以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 PF 對(duì) PC12 細(xì)胞的損傷作用 0、25、50、100、200 μmol / L PF 組 PC12 細(xì)胞活性分別為(100 ±7.65)%、(98.8 ± 13.02)%、(97.9 ± 3.30)%、(96.9 ±3.70)%、(86.6 ± 3.74)%。與 0 μmol / L PF 組比較,25、50、100 μmol / L PF 組細(xì)胞活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t 分別為 0.284、0.498、0.735,P 均 > 0.05),200 μmol / L PF 組細(xì)胞活性明顯降低(t = 3.178,P <0.01)。表明 PF 在 100 μmol / L 及以下濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。

    2.2 各組細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)學(xué)觀察 鏡下觀察可見(jiàn),正常對(duì)照組PC12 細(xì)胞呈圓形,細(xì)胞邊緣完整而清晰;MPP+損傷組PC12 細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞體積明顯縮小,核凝結(jié);陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組細(xì)胞損傷減弱,活細(xì)胞數(shù)量增多,部分細(xì)胞的細(xì)胞核恢復(fù)正常大小,部分細(xì)胞恢復(fù)完整,且隨著PF 濃度的升高,活細(xì)胞數(shù)量增多。見(jiàn)圖1。

    圖1 各組PC12 細(xì)胞形態(tài)的鏡下觀察(× 400)Fig.1 Microscopy of morphology of PC12 cells in various groups(× 400)

    2.3 各組細(xì)胞的活性 正常對(duì)照組、MPP+損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)PC12 細(xì)胞活性分別為(100 ± 0.243)%、(11.2 ±0.094)%、(66.2 ± 0.221)%、(43 ± 0.129)%、(65.4 ±0.129)%、(78.1 ± 0.122)%。MPP+損傷組 A490明顯低于正常對(duì)照組(t = 1 009.56,P < 0.01),表明細(xì)胞受到明顯損傷或部分細(xì)胞已死亡,細(xì)胞活性明顯降低。與MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)細(xì)胞活性明顯升高(t 分別為 654.75、378.57、645.23、796.42,P 均 < 0.01),表明PF 和美多芭可減少細(xì)胞損傷,提高活細(xì)胞數(shù)量。

    2.4 各組細(xì)胞的LDH 釋放量 正常對(duì)照組、MPP+損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol/L)PC12 細(xì)胞的 LDH 釋放率分別為(8.17 ± 0.52)%、(56.25 ± 3.14)%、(23.63 ± 2.23)%、(44.64 ±2.05)%、(33.41 ± 2.43)%、(27.6 ± 1.44)%。與正常對(duì)照組比較,MPP+損傷組LDH 釋放率明顯升高(t = 37.00,P < 0.01);與 MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)LDH 釋放率明顯下降(t 分別為 20.75、7.58、14.09、20.32,P 均<0.01)。表明PF 和美多芭可降低細(xì)胞內(nèi)LDH的釋放。

    2.5 各組細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度 正常對(duì)照組、MPP+損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)PC12 細(xì)胞中 Ca2+濃度分別為(308.7 ± 10.6)、(685.5 ±28.6)、(534.6 ± 20.2)、(471.8 ± 22.8)、(463.8 ±23.2)、(446.3 ± 40.5)nmol / L。與正常對(duì)照組比較,MPP+損傷組 Ca2+濃度明顯升高(t = 24.23,P <0.01),表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。與MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)細(xì)胞 Ca2+濃度明顯降低(t 分別為 9.33、13.21、13.71、14.79,P 均 <0.01)。表明美多芭或 PF 的細(xì)胞保護(hù)作用可能與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+的超載有關(guān)。

    2.6 各組細(xì)胞周期的變化 與正常對(duì)照組比較,MPP+損傷組 S 期細(xì)胞比例明顯下降(t = 11.68,P <0.01),G0 / G1 期細(xì)胞比例明顯升高(t = 7.81,P <0.01);與MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組和藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)G0 / G1 期細(xì)胞比例下降(t 分別為 2.14、0.56、1.33、4.14,P 均 < 0.01),S 期細(xì)胞比例明顯升高(t 分別為 3.90、2.16、4.27、8.90,P 均 < 0.01),見(jiàn)圖 2 和表 1。表明 PF 和美多芭可促進(jìn)MPP+損傷細(xì)胞從G0 / G1 期向S 期轉(zhuǎn)換。

    表1 各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例(%,,n = 3)Tab.1 Percentages of cells at various stages of cell cycles in various groups(%,,n = 3)

    表1 各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例(%,,n = 3)Tab.1 Percentages of cells at various stages of cell cycles in various groups(%,,n = 3)

    注:與正常對(duì)照組比較,aa 表示P < 0.01;與MPP +損傷組比較,b 表示 P < 0.05,bb 表示 P < 0.01。

    組別 G0 / G1 期 G2 / M 期 S 期正常對(duì)照組 48.3 ± 6.67 7.49 ± 1.12 44.23 ± 4.23 MPP+損傷組 79.7 ± 7.24aa 6.71 ± 0.63 13.60 ± 0.7aa陽(yáng)性對(duì)照組 70.2 ± 8.79b 6.87 ± 7.9 23.00 ± 6.3藥物保護(hù)組(μmol / L)100 61.3 ± 7.03bb 3.35 ± 0.07bb 35.30 ± 6.7bb 50 73.8 ± 6.77bb 2.27 ± 0.14bb 23.90 ± 1.41bb 25 77.2 ± 8.38bb 4.04 ± 0.6bb 18.80 ± 0.4bb

    圖2 各組細(xì)胞周期檢測(cè)的流式細(xì)胞圖Fig.2 Flow cytometry of cell cycles in various groups

    2.7 各組細(xì)胞中Caspase-3 的活性 正常對(duì)照組、MPP+損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物保護(hù)組(25、50 和100 μmol / L)PC12 細(xì)胞中 Caspase-3 的活性分別為(100 ± 0.04)%、(245 ± 15.6)%、(160 ± 12.5)%、(213 ± 13.8)%、(176 ± 12.1)%、(134 ± 11.4)%。與正常對(duì)照組比較,MPP+損傷組細(xì)胞中Caspase-3的活性明顯升高(t = 20.69,P < 0.01);與 MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組(25、50 和100 μmol / L)細(xì)胞中 Caspase-3 的活性顯著降低(t 分別為 11.18、4.21、9.08、14.61,P 均 < 0.01)。表明 PF能抑制MPP+誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷引起的Caspase-3活性升高。

    2.8 各組細(xì)胞線粒體的膜電位水平 正常對(duì)照組、MPP+損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物保護(hù)組(25、50 和100 μmol / L)PC12 細(xì)胞線粒體的膜電位水平分別為(100 ± 4.6)%、(38.14 ± 2.74)%、(78.26 ± 3.57)%、(53.16 ± 3.41)%、(79.31 ± 3.84)%、(88.96 ± 3.57)%。與正常對(duì)照組比較,MPP+損傷組細(xì)胞線粒體的膜電位水平明顯下降(t = 29.10,P < 0.05);與 MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組(50 和100 μmol / L)細(xì)胞線粒體的膜電位水平明顯升高(t 分別為 20.17、20.69、25.54,P 均 < 0.05),25 μmol/L藥物保護(hù)組的膜電位水平升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = 7.55,P > 0.05)。表明 MPP+誘導(dǎo) PC12 細(xì)胞受損的效率提高,從而導(dǎo)致線粒體膜電位降低;而PF 能夠增強(qiáng)線粒體膜電位,緩解MPP+對(duì)PC12 細(xì)胞的損傷。

    2.9 各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)水平 正常對(duì)照組、MPP+損傷組、陽(yáng)性對(duì)照組、藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)PC12 細(xì)胞中 Bcl-2 蛋白的表達(dá)水平分別為 0.91 ± 0.075、0.39 ± 0.02、0.66 ± 0.03、0.67 ± 0.04、0.65 ± 0.03、0.68 ±0.03,Bax 蛋白的表達(dá)水平分別為 0.51 ± 0.01、0.85 ± 0.067、0.46 ± 0.02、0.43 ± 0.03、0.41 ±0.03、0.36 ± 0.02,Bcl-2 / Bax 分別為 6.75 ± 0.06、0.45 ± 0.01、1.55 ± 0.02、1.67 ± 0.01、1.72 ± 0.04、2.02±0.01。與正常對(duì)照組比較,Bcl-2/Bax 比值顯著降低(t=29.93,P < 0.01);與 MPP+損傷組比較,陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組(25、50 和 100 μmol / L)細(xì)胞Bcl-2 /Bax 比值明顯升高(t 分別為 63.45、100.2、46.93、138.86,P 均<0.01)。見(jiàn)圖3。表明PF 能夠增加MPP+損傷細(xì)胞后Bcl-2 / Bax 比值,從而發(fā)揮抗凋亡作用。

    圖3 Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)水平Fig.3 Determination of Bcl-2 and Bax expression levels in various groups by Western blot

    3 討 論

    本研究采用MPP+誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型,探討PF 對(duì)該損傷的保護(hù)機(jī)制。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn),與正常對(duì)照組比較,MPP+損傷組PC12 細(xì)胞數(shù)目減少,細(xì)胞形狀呈近似圓形,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞體減小和核凝結(jié),細(xì)胞連接減少;陽(yáng)性對(duì)照組及藥物保護(hù)組細(xì)胞恢復(fù)正常核大小和完整,表明PF 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12 受損細(xì)胞具有顯著的保護(hù)功能。

    有研究表明,在神經(jīng)毒素中暴露神經(jīng)元細(xì)胞,由于細(xì)胞受損,膜通透性發(fā)生了變化,使LDH 釋放量明顯增多,也會(huì)造成胞內(nèi)Ca2+超載,導(dǎo)致細(xì)胞受損[17-18]。同時(shí)線粒體在神經(jīng)退行性變中起關(guān)鍵作用,線粒體作為氧化反應(yīng)及產(chǎn)生活性氧(recutive oxygen species,ROS)的主要場(chǎng)所,MPP+能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)ROS 增多,進(jìn)而降低線粒體膜電位,導(dǎo)致線粒體細(xì)胞色素C 釋放,進(jìn)而激活Caspase-3,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[19]。細(xì)胞凋亡一個(gè)重要特征主要是線粒體膜電位的破壞,線粒體膜電位的破壞作為凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)事件之一,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞凋亡中Caspase-3 是關(guān)鍵的主導(dǎo)者,有實(shí)驗(yàn)證實(shí),Caspase-3 參與MPP+誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,Caspase-3 激活可介導(dǎo)線粒體途徑相關(guān)凋亡的產(chǎn)生[20]。本研究結(jié)果表明,MPP+損傷細(xì)胞后,LDH 釋放量、細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增多及線粒體膜電位降低,PF可通過(guò)逆轉(zhuǎn)這些現(xiàn)象的發(fā)生而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。另外,Caspase-3 在PC12 細(xì)胞中的活性在培養(yǎng)48 h后明顯升高,但 100 μmol / L PF 作用后 Caspase-3 活性降低43%,表明PF 可作為MPP+的拮抗劑。

    有研究表明,細(xì)胞凋亡受Bcl-2 家族作用調(diào)節(jié)蛋白的影響,包括促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl-2[21-22]。有文獻(xiàn)顯示,Bcl-2 可與線粒體膜及 Bax結(jié)合,從而形成Bcl-2 / Bax 異二聚體,引起線粒體通透性過(guò)渡孔關(guān)閉,阻止細(xì)胞色素C 的釋放,從而抑制細(xì)胞凋亡[23-24]。同時(shí),Bcl-2 還可結(jié)合Bak 形成Bak/Bcl-2 異二聚體,受凋亡刺激后,Bax、Bak 能夠形成寡聚體,影響線粒體膜通透性,使細(xì)胞色素C 從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),激活與Caspase 相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。本研究結(jié)果表明,MPP+處理后細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)量降低,Bax 表達(dá)水平升高,導(dǎo)致 Bcl-2 / Bax 比值顯著降低(P < 0.01),經(jīng) PF 處理后 Bcl-2 / Bax 比值顯著增加(P < 0.01),與陽(yáng)性藥物美多芭作用一致。表明PF 的神經(jīng)保護(hù)作用與升高Bcl-2 / Bax 比值有關(guān)。

    綜上所述,PF 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12 損傷細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用,這種作用可能通過(guò)減少LDH 釋放、降低胞內(nèi)Ca2+超載、促進(jìn)細(xì)胞增殖、降低Csapase-3活性、提高線粒體膜電位和Bcl-2 / Bax 比值實(shí)現(xiàn)。本研究為苷類化合物抗PD 作用機(jī)制的進(jìn)一步研究及高效、低毒抗PD 藥物的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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