鳉魚腸激酶在大腸埃希菌中的可溶性表達(dá)、純化及活性鑒定

張五妮，劉玉林，朱秋媚，王江林，畢江坤，俞露，張宇

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司細(xì)胞因子室，吉林 長(zhǎng)春 130012

腸激酶（enterokinase，EK）是一種絲氨酸蛋白酶，普遍存在于脊椎動(dòng)物十二指腸內(nèi)［1-2］。EK 在腸中通過將胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶來啟動(dòng)消化酶的活化［3］，可特異性識(shí)別 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 序列并切割該序列，經(jīng)過EK 酶切獲得的目的蛋白具有天然氮端氨基酸序列［4］。在基因工程領(lǐng)域，EK 是一種重要且常用的工具酶［5］。目前市售的EK 主要包括天然EK、重組人EK、重組牛EK 等。但獲得天然EK 的成本較高［6］，因此通過使用基因工程技術(shù)來制備EK 成為一種重要手段。

研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物來源的EK 特異性較差［7］，往往酶切出非特異性酶切片段，從而導(dǎo)致產(chǎn)生副產(chǎn)物。OGIWARA 等［8］發(fā)現(xiàn)，鳉魚來源的 EK 特異性明顯高于哺乳動(dòng)物來源的EK。鳉魚EK 輕鏈具有完整的催化活性，相對(duì)分子質(zhì)量為26 700，分子內(nèi)有9個(gè)半胱氨酸殘基，可形成4 對(duì)二硫鍵，且該酶的酶切條件較為廣泛，在pH 4.5 ～ 9.5 及4 ～ 45 ℃均具有較好的酶切活性。

大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是常用的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清晰、簡(jiǎn)單，繁殖周期相對(duì)較短，培養(yǎng)方式簡(jiǎn)單，培養(yǎng)成本低，大大降低了生產(chǎn)EK 的成本［9］。但大腸埃希菌缺乏真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)［10］，且外源基因在大腸埃希菌表達(dá)常處于還原性的細(xì)胞質(zhì)中，不易形成正確的二硫鍵，導(dǎo)致無生物活性的包涵體產(chǎn)生。本研究嘗試使用融合標(biāo)簽技術(shù)，通過降低外源蛋白合成速率及改變培養(yǎng)條件等，在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行鳉魚EK 的可溶表達(dá)。在可溶性標(biāo)簽與EK 之間加入EK 酶切位點(diǎn)，通過自酶切反應(yīng)，制備高活性的EK。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒 TransB（DE3）化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、Trans1-T1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；含EK 序列的質(zhì)粒由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；pGEX-4T-1 質(zhì)粒由本公司細(xì)胞因子室保存。

1.2 主要試劑及儀器 含EK 識(shí)別序列的組氨酸標(biāo)簽生長(zhǎng)激素（HisGH）由本公司細(xì)胞因子室保存；生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；重組牛EK 購(gòu)自北京百華百匯生物科技有限公司；TransStart FastPfu DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、5 K DNA marker、8 K DNA marker 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；YeaRed 核酸染料、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）購(gòu)自上海圣翊生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；Quickcut BamHⅠ、Quickcut XhoⅠ購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione transferase，GST）親和層析填料、Q Bestarose High Performance、BXK16 ／ 26 層析柱購(gòu)自上海博格隆生物技術(shù)有限公司；1.5 mL 3 K 超濾管購(gòu)自默克密理博公司；Human Growth Hor-mone Affinity Mahrix 層析填料購(gòu)自賽默飛生物科技有限公司；AKTA Purifier100 購(gòu)自美國(guó)GE 公司；電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD 公司；高效液相色譜儀購(gòu)自鉑金艾爾默公司；液相色譜分析柱（TSKgel G2000-SW）購(gòu)自東曹株式會(huì)社；超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Warters 公司。

1.3 鳉魚EK 基因的擴(kuò)增 從NCBI 中查找鳉魚EK基因（100125449）設(shè)計(jì)并合成引物序列，F(xiàn)W：5′-CGGGATCCGACGACGACGACAAAGTGGTGGGCGGCGTGAACG-3′（下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），RV：5′-GGCTCGAGTTAATCCAGATCGCTAAAGCTG3CTGCGGCGGG-3（′下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為759 bp。引物由吉林省庫(kù)美生物技術(shù)有限公司合成。以含有EK 序列的質(zhì)粒為模板，利用引物FW、RV，使用TransStart FastPfu DNA Polyrrmease 高保真聚合酶對(duì)目的基因進(jìn)行快速擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，69 ℃ 20 s，72 ℃25 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳120 V，50 min 分離后，切膠回收。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-EK 的構(gòu)建 將切膠回收后的PCR 產(chǎn)物及pGEX-4T-1 質(zhì)粒分別用Quickcut BamHⅠ和Quickcut XhoⅠ37 ℃水浴酶切15 min；經(jīng)1%瓊脂糖核酸電泳分離后，切膠回收，回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA Ligase 25 ℃快速連接15 min；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 Trans1-T1 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃，220 r ／ min搖床培養(yǎng) 1 h；取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含 50 μg ／ mL 氨芐青霉素的平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置過夜；挑取4 個(gè)單菌落，接種至含 50 μg ／ mL 氨芐青霉素的 5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)至A600為2.0 時(shí)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切（Quickcut BamHⅠ／ Quickcut XhoⅠ）及1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送長(zhǎng)春庫(kù)美生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5 最佳誘導(dǎo)條件的確定 將上述測(cè)序正確的重組體轉(zhuǎn)化至 TransB（DE3）化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)；挑取單菌落至含50 μg ／ mL 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至A600約1.0 時(shí)，分組接種進(jìn)行誘導(dǎo)條件試驗(yàn)，以誘導(dǎo)劑IPTG 濃度、誘導(dǎo)時(shí)A600及誘導(dǎo)溫度為影響因素。按2%接種比例將菌種接種至含50 μg ／ mL 氨芐青霉素的 5 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至A600分別為0.6 和1.2 時(shí)，開始誘導(dǎo)，IPTG濃度分別為 0.1 和 1.0 mmol／L，誘導(dǎo)溫度設(shè)為 18 和 37 ℃，6 h 后，取樣進(jìn)行15% SDS-PAGE 鑒定。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶中目的蛋白含量。

1.6 目的蛋白的表達(dá)及純化 取保存的甘油菌劃線，挑取單個(gè)菌落接種至含50 μg ／ mL 氨芐青霉素的5 mL LB 培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)；按2%的接種比例接種至含 50 μg ／ mL 氨芐青霉素的 100 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)；至 A600為1.0 時(shí)，按 2%的接種比例接種至含 50 μg ／ mL 氨芐青霉素的 1 000 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r ／ min 培養(yǎng)；至菌液 A600為 0.6 ~0.7 時(shí)，加入 IPTG 至終濃度為 0.1 mmol ／ L，18 ℃培養(yǎng) 6 h；8 000 × g 離心 30 min；收集菌體沉淀，用菌體重量 10 倍體積的重懸液（140 mmol ／ L NaCl，2.7 mmol ／ L KCl，10 mmol ／ L Na2HPO4，1.8 mmol ／ L KH2PO）4重懸20 min；均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，300 bar 1 次，800 bar 3 次；8 000 × g 離心 30 min；收集上清，用平衡液（140 mmol ／ L NaCl，2.7 mmol ／ L KCl，10 mmol ／ L Na2HPO4，1.8 mmol ／L KH2PO4，pH 7.4）以 100 cm ／ h的線性流速平衡10 個(gè)柱體積（column volume，CV）GST 親和層析柱（BXK16 ／ 26，5 mL）后上樣，平衡液淋洗 5 CV，洗脫液（50 mmol ／ L Tris-HCl，pH 7.4，10 mmol ／ L GSH）洗脫，收集洗脫主峰。GST 層析主峰經(jīng)過室溫過夜自酶切后進(jìn)行Q Bestarose HP 層析（BXK16 ／ 26，5 mL）。用平衡液（20 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0）以 3.3 mL ／min 流速平衡層析柱 10 CV后，將GST 主峰過夜酶切樣品上樣，以平衡液淋洗5 CV 后進(jìn)行鹽離子濃度梯度洗脫。洗脫方法為：100%平衡液→100%洗脫液（20 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0，0.3 mol ／ L NaCl），10 CV。分峰收集樣品進(jìn)行HisGH 酶切試驗(yàn)，以確定EK 峰。收集的EK 峰經(jīng)3 K 超濾管濃縮后，采用 Lowry 法檢測(cè)濃度［11-12］，HPLC 法檢測(cè)純度［13-16］。

1.7 EK 活性分析 以HisGH 為底物，檢測(cè)Q Bestarose HP 層析純化獲得的鳉魚EK 比活性。將HisGH用 20 mmol ／ L Tris-HCl，pH 8.0 緩沖液稀釋至終濃度1 mg／mL，將重組蛋白每1 mg 為1 份加至1.5 mL離心管中，再分別加入 1、10、20、30、40、50、60、70、80和 90 μL 鳉魚 EK 及 1 mmol ／ L CaCl2、0.1% Tween-20，置37 ℃酶切16 h；酶切樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE鑒定。酶切90%以上HisGH 的EK 最小用量（mg）的倒數(shù)即為酶的比活，按下式計(jì)算。

酶的比活（IU ／ mg）= 1 ／（濃度 × 最小用量 × 純度）

1.8 EK 酶切特異性試驗(yàn) 分別用本研究的鳉魚EK（20 mL 1 mg ／ mL HisGH，0.8 mL 0.23 mg ／ mL 鳉魚EK，22 μL 1 mol／L CaCl）2和商品重組牛EK（20 mL 1 mg ／ mL HisGH，10 μL 重組牛 EK）酶切 HisGH，酶切產(chǎn)物首先進(jìn)行Ni 柱層析，收集流穿液進(jìn)行生長(zhǎng)激素親和層析（Human Growth Hormone Affinity Mahrix，BXK16 ／ 26，5 mL），以 GH 標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，收集主峰進(jìn)行超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜儀相對(duì)分子質(zhì)量定性分析檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 鳉魚EK 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 目的基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見759 bp 的條帶，大小與理論值相符。見圖1。

圖1 EK 基因PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of EK gene

2.2 重組質(zhì)粒pGEX-EK 的鑒定 質(zhì)粒的的雙酶切（BamHⅠ／ XhoⅠ）產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見4 984 和759 bp 的條帶，大小與理論值相符。見圖2。測(cè)序結(jié)果顯示與目的基因序列相符。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-EK 的雙酶切（BamHⅠ／XhoⅠ）鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pGEX-EK（BamHⅠ／ XhoⅠ）

2.3 最佳誘導(dǎo)條件 結(jié)果顯示，37 和18 ℃培養(yǎng)條件下目的蛋白均有表達(dá)，且誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)量影響較小。A600為0.6 時(shí)誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量明顯優(yōu)于A600為1.2。見圖3。確定最佳誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)溫度 18 ℃，A600為 0.6 時(shí)誘導(dǎo)，IPTG 濃度為0.1 mmol ／ L。

圖3 不同誘導(dǎo)條件下重組蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Expression of recombinant protein under various conditions for induction

2.4 表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定 結(jié)果顯示，37 ℃培養(yǎng)條件下，GST-EK 蛋白均存在于均質(zhì)后離心沉淀中，上清中無可溶性目的蛋白，經(jīng)GST 層析，主峰中未見目的蛋白。18 ℃培養(yǎng)條件下，均質(zhì)后離心上清及沉淀中均含有目的蛋白，經(jīng)GST 層析，主峰中含有較多目的蛋白。見圖4 ~ 圖6。18 ℃培養(yǎng)條件下的菌體經(jīng)破碎離心后進(jìn)行GST 層析，GST 層析主峰經(jīng)過夜自酶切后進(jìn)行Q Bestarose HP 層析，純化圖譜顯示，Q Bestarose HP 層析出現(xiàn)5 個(gè)主峰，見圖7。Q Bestarose HP 層析各成分經(jīng)15% SDS-PAGE 分析可見，峰1 ~ 3 蛋白濃度較低，峰4 ~ 5 蛋白濃度較高。見圖8。

圖4 18、37 ℃發(fā)酵菌體GST 層析圖Fig.4 GST chromatogram of fermentation supernatant at 18 and 37 ℃

圖6 37 ℃誘導(dǎo)后GST 層析產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE profile of expressed protein induced at 37 ℃after purification by GST chromatography

圖7 Q Bestarose HP 層析圖譜Fig.7 Q Bestarose HP chromatographic profile

圖8 Q Bestarose HP 層析產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.8 SDS-PAGE profile of protein purified by Q Bestarose HP chromatography

收集Q Bestarose HP 層析下樣進(jìn)行酶切HisGH試驗(yàn)，結(jié)果顯示，主峰3 ~ 5 均具有酶切活性，但主峰3 蛋白濃度較低卻有較高的酶切活性。見圖9。確定主峰3 為EK 峰。

圖9 Q Bestarose HP 各主峰酶切HisGH 試驗(yàn)Fig.9 Enzyme digestion HisGH test on various main peaks on Q Bestarose HP chromatographic profile

Q Bestarose HP 主峰3 超濾濃縮后蛋白濃度為278 μg ／ mL。見圖 10。

圖10 Lowry 法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.10 Standard curve of Lowry method

2.5 鳉魚EK 酶切活性 結(jié)果顯示，酶切90%以上HisGH 的 EK 最小用量為 90 μL，見圖 11。EK 純度為86.8%，見圖12。確定酶的比活為46 IU ／ mg。

圖5 18 ℃誘導(dǎo)后GST 層析產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of expressed protein induced at 18 ℃after purification by GST chromatography

圖11 酶切活性鑒定Fig.11 Identification of enzyme digestion activity

圖12 EK 純度的HPLC 法檢測(cè)Fig.12 Determination of purity of EK by HPLC

2.6 鳉魚EK 酶切特異性 結(jié)果顯示，重組牛EK 酶切出非特異性片段（相對(duì)分子質(zhì)量21 468.0），重組鳉魚EK 未見非特異酶切片段，且與對(duì)照品相符（相對(duì)分子質(zhì)量22 125.0）。見圖13。

圖13 酶切產(chǎn)物質(zhì)譜相對(duì)分子質(zhì)量分析Fig.13 Analysis of relative molecular mass of enzyme digested products

3 討 論

有研究顯示，鳉魚EK 的酶切專一性明顯高于哺乳動(dòng)物來源的EK 的酶切專一性，是近幾年克隆出的比較特殊的EK，被公認(rèn)為具有較大發(fā)展?jié)摿Φ幕蚬こ坦ぞ呙福?］。但與天然EK 相比，鳉魚EK 的活性較低。

本研究利用融合標(biāo)簽技術(shù)［17-20］，成功構(gòu)建了pGEX-EK 表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至TansB 表達(dá)菌株后經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)酵獲得GST-EK 融合蛋白。不同表達(dá)條件的電泳結(jié)果顯示，IPTG 濃度對(duì)表達(dá)結(jié)果無明顯影響。可能由于IPTG 作為一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑且不易被細(xì)菌代謝，低濃度下即可誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，過量存在的IPTG 對(duì)蛋白表達(dá)水平影響不大［21-22］。

誘導(dǎo)A600為0.6 時(shí)，目的蛋白表達(dá)量明顯優(yōu)于誘導(dǎo)A600為1.2 時(shí)。可能由于誘導(dǎo)菌體密度較大時(shí)，細(xì)菌處于指數(shù)生長(zhǎng)后期或平臺(tái)期，細(xì)菌內(nèi)酶活性降低，導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平降低［22］。因此，選擇誘導(dǎo)A600=0.6 作為后續(xù)試驗(yàn)的表達(dá)條件之一。

由不同發(fā)酵溫度條件獲得的菌體經(jīng)純化后發(fā)現(xiàn)，37 ℃培養(yǎng)的菌體表達(dá)后均質(zhì)上清無目的條帶，18 ℃培養(yǎng)的菌體表達(dá)后均質(zhì)上清有目的條帶，兩種條件下均質(zhì)后離心沉淀均有目的條帶?？赡苁怯捎?7 ℃條件下蛋白合成速度較快，引起蛋白大量聚集從而形成包涵體，18 ℃條件下蛋白合成速度較慢，有利于所表達(dá)蛋白的胞內(nèi)可溶。也可能由于目的蛋白溶解性及促溶標(biāo)簽的因素，即使在較低的蛋白表達(dá)速度下仍有部分蛋白形成包涵體［23］。

GST 親和層析電泳結(jié)果顯示，洗脫主峰電泳結(jié)果存在2 條主帶，相對(duì)分子質(zhì)量分別為27 600 和54 000，符合GST-EK（理論相對(duì)分子質(zhì)量54 150）酶切產(chǎn)物GST（理論相對(duì)分子質(zhì)量27 430）和EK（理論相對(duì)分子質(zhì)量26 720）的相對(duì)分子質(zhì)量。菌體電泳結(jié)果顯示，在菌體收獲階段僅存在GST-EK。因此GST-EK 自酶切是發(fā)生在菌體破碎過程中，酶切產(chǎn)物為GST 和EK。對(duì)于本研究，期望自酶切反應(yīng)發(fā)生在GST 層析后，因此在菌體破碎階段通過向緩沖液中添加NaCl 抑制自酶切反應(yīng)［24-26］。

GST 層析洗脫主峰經(jīng)自酶切后進(jìn)行Q Bestarose HP 層析，洗脫產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定，確定洗脫峰3、4 和5 具有酶切活性且活性依次降低，確定洗脫峰3 為EK。其中，洗脫峰4 和5 具有酶切活性可能是由于Q Bestarose HP 層析未完全分離EK 與GST，導(dǎo)致洗脫峰4 和5 含有少量EK。

本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)重組HisGH 的研究中發(fā)現(xiàn)，重組牛EK 酶切HisGH 時(shí)除DDDDK 位點(diǎn)外存在非特性酶切（相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表）。本研究通過對(duì)比重組鳉魚EK 和重組牛EK 以HisGH 為底物的酶切產(chǎn)物，評(píng)價(jià)兩種酶的酶切特異性。酶切產(chǎn)物經(jīng)Ni 親和層析，去除HisGH 及His 標(biāo)簽，收集的流穿液中含有EK、GH及其他酶切產(chǎn)物。將該流穿液上樣GH 親和層析，洗脫樣品含有GH 及其他酶切產(chǎn)物。該GH 親和層析介質(zhì)的GH 親和配體是駱駝源單結(jié)構(gòu)域抗體片段，可特異性結(jié)合GH 抗原位點(diǎn)。因此可用于捕獲完整GH 或GH 片段。通過對(duì)親和層析洗脫樣品的質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，重組牛EK 的酶切產(chǎn)物有多種不同的相對(duì)分子質(zhì)量，重組鳉魚EK 的酶切產(chǎn)物具有單一相對(duì)分子質(zhì)量且與對(duì)照品一致。因此，鳉魚EK 具有更高的特異性。

綜上所述，本研究通過大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)以及融合標(biāo)簽技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了鳉魚EK 的可溶性表達(dá)及純化。該鳉魚EK 經(jīng)鑒定較重組牛EK 具有更高的特異性，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。