益生菌大腸埃希菌Nissle1917 鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)分析及表位預(yù)測(cè)

楊穎 ，鄧永軍 ，張進(jìn) ，區(qū)炳明 ，朱國(guó)強(qiáng) ，文明

1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061；4.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009

大腸埃希菌Nissle 1917（EcN）是革蘭陰性益生菌［1］。研究發(fā)現(xiàn)，EcN 對(duì)常見(jiàn)的胃腸道炎癥疾病有較好的治療效果［2-3］，其作用機(jī)制在于EcN 能在人體腸道定殖，并阻止一些病原菌對(duì)腸道黏膜的侵襲，能保護(hù)和修護(hù)腸道黏膜屏障［4-5］。動(dòng)物試驗(yàn)表明，EcN 可應(yīng)用于治療新生犢牛的腹瀉疾?。?-7］，還可用于構(gòu)建益生菌活疫苗，預(yù)防F4+及F18+大腸埃希菌所致仔豬斷奶后腹瀉和水腫疾病等［8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，EcN 還具有腫瘤靶向作用，是良好的藥物載體，且與化療藥物聯(lián)用可增強(qiáng)藥物抗腫瘤的療效［9-10］。

細(xì)菌鞭毛蛋白（FliC）由 D0、D1、D2、D3 4 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中D0 和D1 是FliC 的保守區(qū)，位于蛋白序列的-NH3端和-COOH 端，由α 螺旋結(jié)構(gòu)組成；D2 和D3 為其高變區(qū)，位于蛋白序列中部，由β 折疊構(gòu)成。FliC 作為一種病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面的Toll 樣受體5（Toll-like receptor 5，TLR5）激活下游信號(hào)通路，從而激發(fā)固有和獲得性免疫應(yīng)答［11-13］。有研究報(bào)道，F(xiàn)liC 佐劑活性與觸發(fā)TLR5 信號(hào)的能力有關(guān)，TLR5 靶序列位于FliC D1 保守區(qū)域［14］；也有研究表明，D0 區(qū)域也參與了鞭毛蛋白與TLR5 的相互作用，但作用機(jī)制尚未明確［15］；FliC 的 D2 和 D3 區(qū)域序列在不同種屬細(xì)菌中高度可變，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)FliC 的抗體。有研究表明，F(xiàn)liC 高變區(qū)是其發(fā)揮黏膜佐劑活性的重要區(qū)域［16］，也有研究表明，缺失FliC 高變區(qū)不影響其佐劑活性［17］。FliC 自身結(jié)構(gòu)賦予其高效靈活的佐劑活性，通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)與其佐劑活性的關(guān)系以適用于不同類(lèi)型疫苗的研發(fā)，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［18-21］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析EcN FliC的基本理化特性，對(duì)其結(jié)構(gòu)及優(yōu)勢(shì)B 和T 細(xì)胞表位進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，為后續(xù)進(jìn)一步研究其佐劑特性及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列 通過(guò)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得EcN FliC 氨基酸序列（AXY44884.1），序列如下：MAQVINTNSLSLITQNNINKNQSALSSSIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTSNIKGLTQAARNANDGISVAQTTEGALSEINNNLQRIRELTVQASTGTNSDSDLDSIQDEIKSRLDEIDRVSGQTQFNGVNVLAKDGSMKIQVGANDGQTITIDLKKIDSDTLGLNGFNVNGSGTIANKAATISDLTAAKMDAATNTITTTNNALTASKALDQLKDGDTVTIKADAAQTATVYTYNASAGNFSFSNVSNNTSAKAGDVAASLLPPAGQTASGVYKAASGEVNFDVDAN -GKITIGGQEAYLTSDGNLTTNDAGGATAATLDGLFKKAGDGQSIGFNKTASVTMGGTTYNFKTGADAGAATANAGVSFTDTASKETVLNKVATAKQGTAVAANGD -TSATITYKSGVQTYQAVFAAGDGTASAKYADNTDVSNATATYTDADGEMTTIGSYTTKYSIDANNGKVTVDSGTGTGKYAPKVGAEVYVSANGTLTTDATSEGTVTKDPLKALDEAISSIDKFRSSLGAIQNRLDSAVTNLNNTTTNLSEAQSRIQDADYATEVSNMSKAQIIQQAGNSVLAKANQVPQQVLSLLQG。

1.2 EcN FliC 理化性質(zhì)的分析 應(yīng)用ProtParam 在線(xiàn)工具（https: ／ ／ web.expasy.org ／ protparam ／）對(duì) EcN FliC 理化特性進(jìn)行分析，包括氨基酸數(shù)、相對(duì)分子質(zhì)量，理論pI、正負(fù)電荷殘基數(shù)，原子組成，原子總數(shù)和消光系數(shù)等。

1.3 EcN FliC 親水性的分析 應(yīng)用Protscale 在線(xiàn)工具（https:／／web.expasy.org ／protscale ／）對(duì) EcN FliC親疏水性進(jìn)行分析。

1.4 EcN FliC 二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析 應(yīng)用PSIPRED 軟件（http: ／ ／ bioinf.cs.ucl.ac.uk ／ psipred ／）及DNAstar 軟件中的Protean 程序（包括Garnier-Robson 和Chou-Fasman 兩種方法）預(yù)測(cè)分析 EcN FliC 的二級(jí)結(jié)構(gòu)［22-23］。

1.5 EcN FliC 三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析 應(yīng)用I-TASSER 在線(xiàn)軟件（https: ／ ／ zhanglab.ccmb.med.umich.edu ／ ITASSER ／）預(yù)測(cè)EcN FliC 的三級(jí)結(jié)構(gòu)［24］。

1.6 EcN FliC B 及T 細(xì)胞表位的分析 應(yīng)用在線(xiàn)DNAstar 中 Protean 軟件（Kyte-Doolittle 法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親水性，Emini 法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的表面可及性，Karplus-Eisenberg 法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的柔韌性，Jameson-Wolf 法預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的抗原指數(shù)）和ABCpred 軟件綜合預(yù)測(cè)EcN FliC 的B 細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位；利用細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http: ／ ／ www.imtech.res.in ／ raghava ／ propred ／）預(yù)測(cè)EcN FliC 的T細(xì)胞表位［25］。

2 結(jié) 果

2.1 EcN FliC 的理化性質(zhì) EcN FliC 的相對(duì)分子質(zhì)量為60 937.57，分子式為C2584H4201N745O940S6，理論pI 為4.68，脂肪氨基酸指數(shù)為76.74，不穩(wěn)定指數(shù)為15.23，屬于穩(wěn)定蛋白。EcN FliC 由595 個(gè)氨基酸組成，包含17 種氨基酸，其中Ala 含量最高，為14.3%；其次是Thr，含量為12.3%；Met 和Pro 含量較低，分別為1%和0.8%；不包含Cys、His 和Trp。見(jiàn)圖1。

圖1 EcN FliC 的氨基酸組成Fig.1 Animo acid composition of EcN FliC

2.2 EcNFliC 的親水性 EcN FliC 帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）共59 個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）共45 個(gè)，親水性平均值為-0.324，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。序列中第19 位Asn 親水性最強(qiáng)，分值為-2.356；第267 位的Leu 疏水性最強(qiáng)，分值為1.467。見(jiàn)圖2。

圖2 EcN FliC 的親水性分析Fig.2 Analysis of hydrophilicity of EcN FliC

2.3 EcN FliC 的二級(jí)結(jié)構(gòu) PSIPRED 分析表明，EcN FliC 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括 α 螺旋、β 折疊、無(wú)規(guī)則卷曲3 種結(jié)構(gòu)類(lèi)型，其中α 螺旋占42.86%，β 折疊占12.77%，無(wú)規(guī)則卷曲占44.37%。二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占據(jù)整個(gè)蛋白的大部分區(qū)域，是EcN FliC 的主要結(jié)構(gòu)。見(jiàn)圖3。Garnier-Robson 及Chou-Fasman 法進(jìn)一步預(yù)測(cè)EcN FliC 的二級(jí)結(jié)構(gòu)表明，α 螺旋主要位于 9 ～ 32、45 ～ 98、104 ～ 127、505 ～592 等區(qū)段，β 折疊主要位于 2 ～ 6、134 ～ 139、143 ～151、155 ～ 161、225 ～ 229、234 ～ 240、296 ～ 300、410 ～ 417、438 ～ 444、445 ～ 450、466 ～ 470、485 ～489 等區(qū)段，無(wú)規(guī)則卷曲主要位于 101 ～ 105、150 ～ 154、251 ～ 286、315 ～ 321、332 ～ 335、396 ～ 403、443 ～ 446、497 ～ 501 等區(qū)段。見(jiàn)圖4。

圖3 PSIPRED 軟件分析EcN FliC 的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Analysis of secondary structure of EcN FliC by using PSIPRED software

圖4 DNAStar 軟件分析EcN FliC 的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Analysis of secondary structure of EcN FliC by DNAStar software

2.4 EcN FliC 的三級(jí)結(jié)構(gòu) EcN FliC 三級(jí)結(jié)構(gòu)模型質(zhì)量評(píng)估系數(shù)C-score 區(qū)間為-5 ～2，分值越高模型可信度越高；TM-score 代表結(jié)構(gòu)相似度系數(shù)分值＞0.5，表明模型具有正確的結(jié)構(gòu)拓?fù)?，可信度高。選擇C-score 值最高且TM-score ＞0.5 的模型作為預(yù)測(cè)模型。見(jiàn)圖5。

圖5 EcN FliC 的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of tertiary structure of EcN FliC

2.5 EcN FliC 的 B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè) DNAstar 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，含B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域主要位于第9 ～19、35 ～ 50、89 ～ 104、157 ～ 178、251 ～ 265、282 ～ 301、302 ～ 322、327 ～ 339 位氨基酸，見(jiàn)圖 6。在線(xiàn)軟件ABCpred 預(yù)測(cè)結(jié)果表明，得分在0.68 以上的B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位區(qū)域見(jiàn)表1。結(jié)合兩種方法綜合篩選EcN FliC 的優(yōu)勢(shì) B 細(xì)胞表位 13 個(gè)，分別為 9 ～ 18、39 ～ 48、80 ～ 89、93 ～ 102、122 ～ 131、157 ～ 166、217 ～ 226、254 ～ 263、283 ～ 292、288 ～ 297、294 ～ 303、312 ～ 321、332 ～ 341。

表1 ABCpred 軟件預(yù)測(cè)EcN FliC B 細(xì)胞表位Tab.1 Prediction B cell epitopes of EcN FliC by ABCpred software

圖6 EcN FliC 的柔韌性、抗原指數(shù)和表面可及性預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of flexibility，antigen coefficient and surfaceprobability of EcN FliC

2.6 EcN FliC 的T 細(xì)胞表位預(yù)測(cè) CTL 表位預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果表明，EcN FliC 有3 個(gè)CTL 優(yōu)勢(shì)表位，分別為NTSAKAGDV（255 ～264 位氨基酸）、TANAGVSFT（364 ～ 373 位氨基酸）和 VSANGTLTT（487 ～ 496 位氨基酸），得分均為1。

3 討 論

鞭毛為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，其絲狀部由成百上千個(gè)FliC 組成，F(xiàn)liC 的佐劑活性是目前研究的熱點(diǎn)，這有賴(lài)于該蛋白的結(jié)構(gòu)特性，即蛋白兩端高度保守區(qū)和中部高變區(qū)，不同區(qū)域?qū)liC 佐劑活性的作用尚未明確［14-17］。不同種屬細(xì)菌的FliC 氨基酸組成差異較大［26-27］，針對(duì)不同細(xì)菌FliC 的特性進(jìn)行分析，以進(jìn)一步研究其佐劑活性，開(kāi)發(fā)高效佐劑產(chǎn)品。

本研究以益生菌EcN FliC 作為切入點(diǎn)，利用生物信息學(xué)方法和相關(guān)軟件對(duì)EcN FliC 的氨基酸序列進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，EcN FliC 為酸性、親水性蛋白，總平均親水性值為-0.324；二級(jí)結(jié)構(gòu)中α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比最多，β 折疊結(jié)構(gòu)占比最少。由于EcN FliC 氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的模板序列同源度低，未能獲取可信度高的預(yù)測(cè)結(jié)果，因此通過(guò)穿線(xiàn)法預(yù)測(cè)EcN FliC 三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果表明，EcN FliC 三級(jí)結(jié)構(gòu)模型質(zhì)量評(píng)估系數(shù)C-score 區(qū)間為-5 ～2，TM-score 代表結(jié)構(gòu)相似度系數(shù)分值 ＞0.5，表明模型可信度較高，該結(jié)果與沙門(mén)菌FliC 的晶體結(jié)構(gòu)相似［28］。

本研究預(yù)測(cè)B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位時(shí)，將EcN FliC 二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與親水性區(qū)域、柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性等預(yù)測(cè)結(jié)果作為參數(shù)，結(jié)合ABCpred 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，分析出具有更高可信度的B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位13 個(gè)，同時(shí)預(yù)測(cè)出3 個(gè)CTL 優(yōu)勢(shì)表位。FliC 的內(nèi)在抗原性會(huì)導(dǎo)致特異性抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而在連續(xù)性治療過(guò)程中阻礙其佐劑活性，這也成為FliC 臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的障礙［29］。因此，今后將進(jìn)一步研究FliC佐劑活性與抗原性相關(guān)決定簇之間的相關(guān)性。