嚙齒類肝炎病毒感染大鼠模型的建立

馬鑫宇，官月嬋，吳爽靖，謝明學(xué)，畢研偉，寸韡

1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650000

嚙齒類肝炎病毒（Rodent Hepacivirus，RHV）是一種通過血液傳染大鼠的肝炎病毒［1］，與人類丙型肝炎病毒（hepaci C virus，HCV）具有同源性［2-3］。RHV屬于單鏈RNA 病毒，基因組全長9 600 bp，包括5′UTR、1 個不間斷的開放閱讀框（open reading frame，ORF）和 3′UTR，ORF 至少編碼 10 種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白（core、E1、E2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。RHV rn1 亞型（RHV-rn1）的 5′和3′端UTR 中包含多個蛋白裂解位點和二級結(jié)構(gòu)，其中5′非編碼區(qū)含有2 個miR-122 結(jié)合位點。

RHV-rn1 可造成慢性高滴度病毒血癥，引起慢性感染及漸進性肝損傷，宿主具有干擾素通路持續(xù)激活癥狀，這些臨床癥狀與人類HCV 感染較相似，同時，HCV 的抗病毒藥物可抑制RHV 感染，表明RHV-rn1感染的大鼠模型具有作為研究人類HCV 替代模型的潛力［4-6］。因此，建立RHV-rn1 感染的大鼠模型有助于HCV 的相關(guān)研究，但目前尚無可行的細(xì)胞培養(yǎng)體系，無法通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得病毒顆粒［7-8］。前期研究發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)錄獲得的病毒全長基因組RNA 經(jīng)注射進入宿主體內(nèi)可能誘發(fā)病毒感染，如大麥條紋花葉病毒（barley stripe mosaic virus，BSMV）［9］、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）［10］、兔出血熱病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）［11］和HCV［12］等。本研究采用反向遺傳學(xué)方法獲得RHV-rn1，直接注射至大鼠體內(nèi)，建立RHV-rn1 感染的大鼠模型，以期為人類HCV 的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒 質(zhì)粒pcw1057［根據(jù)NCBI 登錄的RHV-rn1 基因組（KX905133.1）合成病毒 cDNA 序列，全長9 656 bp，連接至含有T7 啟動子的載體上］由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ購自美國NEB公司；體外轉(zhuǎn)錄T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System 試劑盒購自美國Promega 公司；RNA純化回收試劑盒RNeasy Mini Kit 購自德國Qiagen公司；Trizol 試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；DL10000 DNA marker 購自上海捷瑞生物工程有限公司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 實驗動物 SPF 級 Wistar 大鼠，雌性，3 ～ 6月齡，體重約180 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，動物合格證號為：XDWSYB20210228。實驗對大鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照本研究所動物倫理相關(guān)規(guī)定進行（文件號為：DWLL202007001）。

1.4 體外轉(zhuǎn)錄RNA 及純化 將質(zhì)粒pcw1057 經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ酶切，用酚氯仿抽提線性化DNA，體外轉(zhuǎn)錄T7 RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System 試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)RNeasy Mini Kit 試劑盒純化，獲得RHV-rn1 基因全長RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 動物分組及給藥 分別經(jīng)大鼠肝內(nèi)直接注射和尾靜脈注射途徑給予純化的RHV-rn1 基因全長RNA，5 μg ／（100 μL·只），每組 2 只；同時設(shè)對照組（PBS，100 μL ／ 只），1 只。

1.6 大鼠血清中RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)的檢測 采用RT-qPCR 法。用One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）試劑盒測定RHV-rn1 基因全長RNA 濃度，根據(jù)濃度計算基因組拷貝數(shù)，即為RT-qPCR法的標(biāo)準(zhǔn)品。以RHV-rn1 基因組序列5′-TACATGGCTAAGCAATACGG-3′為正鏈引物，5′-AAGCGCAGCACCAATTCC-3′為負(fù)鏈引物，5′-CTCACGTACATGACGTACGGCATG-3′為特異性 taqman FAM 探針，引物和探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成。注射后2 d 起每日經(jīng)各組大鼠尾靜脈采血，至7 d，隨后每7 d 采血，肝內(nèi)注射組和對照組采血至49 d，尾靜脈注射組采血至28 d，分離血清，Trizol 試劑提取RNA，以其為模板進行RT-qPCR 擴增。RT-qPCR 擴增條件為：42 ℃5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 15 s，共 45 個循環(huán)；53 ℃45 s，60 ℃ 45 s。利用RT-qPCR 法標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算大鼠血清中RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)。

1.7 子代RHV-rn1 感染能力的檢測 將純化的RHV-rn1 基因全長 RNA 經(jīng)肝內(nèi)注射大鼠，5 μg ／（100 μL·只），注射后 49 d 經(jīng)尾靜脈采血，分離血清（P0 代 RHV-rn1）；另取 4 只大鼠（編號 1 ～ 4），經(jīng)尾靜脈注射 P0 代 RHV-rn1，100 μL ／只，同時設(shè) PBS 對照組，注射后 3、14、56、106、134 d 經(jīng)尾靜脈采血，分離血清，采用 RT-qPCR 法（同 1.6 項）檢測 RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)。

1.8 RHV-rn1 對大鼠器官親嗜性的檢測 將P0 代RHV-rn1 經(jīng)尾靜脈注射大鼠，100 μL ／ 只，注射后第7 天經(jīng)腹主動脈采血，分離血清，即P1 代RHV-rn1，相同方法獲得 P2 和 P3 代 RHV-rn1，RT-qPCR 法（同1.6 項）檢測RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)。取RHV-rn1在體內(nèi)傳至P3 代時的3 只大鼠，無菌取大鼠的肌肉、腦、甲狀腺、肺、小腸、腎臟、性器官、心臟、脾臟、肝臟組織，剪成小塊，研磨，制備為細(xì)胞懸液，用Trizol 提取 RNA，RT-qPCR 法（同 1.6 項）檢測 RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)。

1.9 RHV-rn1 感染能力的檢測 分別用劑量為101、102、103、104、105copies ／ μL 的 P3 代 RHV-rn1 經(jīng)尾靜脈注射大鼠，100 μL ／ 只，于注射后 0、3、6、12 d，經(jīng)尾靜脈采血，分離血清，采用RT-qPCR 法（同1.6項）檢測RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 RHV-rn1 基因全長RNA 的鑒定 純化的RHV-rn1 基因全長RNA 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，于約10 000 bp 處可見目的基因條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 RHV-rn1 基因全長RNA 電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of full-length RNA of RHV-rn1 gene

2.2 大鼠血清中的RHV-rn1 基因組拷貝數(shù) 肝內(nèi)注射組2 只大鼠于注射后2 d 出現(xiàn)高滴度病毒血癥，血液中RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)達 105copies ／ μL，注射后 3 d拷貝數(shù)大幅下降，注射后 4 d 上升，達 105copies／μL，隨后呈緩慢上升趨勢；至注射后14 d 開始穩(wěn)定，維持約在 106copies ／ μL，可持續(xù)至注射后 49 d。尾靜脈注射組2 只大鼠直至28 d 時未檢測到病毒血癥。見圖2。

圖2 RT-qPCR 法檢測各組大鼠血清中RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)Fig.2 Determination of RHV-rn1 genome copy number in sera of rats by RT-qPCR

2.3 子代 RHV-rn1 的感染能力 P0 代RHV-rn1注射3 d 后，大鼠血清中RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)為105copies ／ μL；隨后血清中的拷貝數(shù)逐漸上升，至14 d 時，維持約在 106copies ／ μL。見表 1。表明 P0代大鼠血液中含有感染性RHV-rn1 顆粒，且可形成慢性感染。

表1 感染子代 RHV-rn1 大鼠血清中的 RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)（copies ／ μL）Tab.1 Genome copy numbers of RHV-rnl in sera of rats infected with offspring HRV（copies ／ μL）

2.4 RHV-rn1 對大鼠器官的親嗜性 P1、P2、P3 代RHV-rn1 的拷貝數(shù)分別為 1.12 × 107、7.5 × 106、1.65 × 107copies ／ μL。RHV-rn1 在體內(nèi)傳至 P3 代時，大鼠的肌肉、腦、甲狀腺、肺、小腸、腎臟、性器官、心臟、脾臟、肝臟組織中，肝臟中的RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)達107copies ／ mg，高于其他組織器官1 000 倍以上，見圖3。表明RHV-rn1 是一種嗜肝性病毒。

圖3 大鼠不同器官／ 組織中RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)Fig.3 Genome copy numbers of RHV-rnl in various organs ／tissues of rats

2.5 RHV-rn1 的感染能力 RHV-rn1 半數(shù)感染的基因組拷貝數(shù)為102.5copies，見圖4，表明RHV-rn1具有較強的感染能力。

圖4 RHV-rn1 半數(shù)感染劑量試驗Fig.4 Test for median infectious dose of RHV-rn1 of P3

3 討 論

本研究采用經(jīng)反向遺傳學(xué)方法合成RHV-rn1基因組cDNA，體外轉(zhuǎn)錄獲得的病毒基因組RNA［13-14］，通過肝臟注射至大鼠體內(nèi)，在體內(nèi)擴增病毒，建立該動物模型，于不同時間點采血，分離血清，RT-qPCR 法檢測RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)。檢測結(jié)果顯示，接種RHV-rn1 后，大鼠可形成高滴度病毒血癥，且可形成慢性感染，表明RHV-rn1 基因組含有完整的5′和3′UTR 結(jié)構(gòu)，具有使大鼠形成病毒血癥的能力。

人類乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和 HCV均是慢性肝炎病毒，有研究表明，通過尾靜脈直接注射HBV 基因組可在小鼠體內(nèi)形成高滴度病毒血癥［14］，HCV 則通過肝內(nèi)直接注射病毒基因組感染黑猩猩形成病毒血癥［15］。RHV-rn1 也為慢性肝炎病毒，因此本實驗采用尾靜脈和肝內(nèi)注射兩種方式給予RHV-rn1 RNA，RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，肝內(nèi)注射組大鼠血清中的RHV-rn1 基因組拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于尾靜脈注射組及對照組，尾靜脈注射組與對照組差異較小，表明RHV-rn1 基因組RNA 經(jīng)肝內(nèi)注射具有較強的感染能力，可能是由于肝臟細(xì)胞具有較強的吸收外來物質(zhì)的能力，病毒RNA 更易進入肝細(xì)胞，有利于病毒基因組復(fù)制。

模擬RHV 血液傳播的過程，本實驗用P0 代大鼠血清成功感染健康大鼠，表明子代RHV 具有較強的感染能力，可形成慢性感染，且對肝臟有較強的親嗜性。通過個體傳代，獲得了P1、P2、P3 代病毒，拷貝數(shù)分別為 1.12 × 107、7.5 × 106、1.65 × 107copies ／ μL。RHV-rn1 感染能力試驗計算得出，RHV-rn1病毒半數(shù)感染的基因組拷貝數(shù)為102.5copies，表明RHV-rn1具有極強的感染能力，僅需感染大鼠的1 μL 血液就能感染其他健康大鼠，是一種傳染性較強的病毒。本研究建立了RHV-rn1 感染的大鼠模型，為慢性肝炎致病機理和免疫反應(yīng)的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。