卡介苗新菌種單細(xì)胞克隆株NIFDC 945 SⅢ免疫效應(yīng)及安全性的初步評(píng)價(jià)

江秋虹，張健，程琛舒，趙愛(ài)華，陶立峰，蒲江，付麗麗，王國(guó)治

1.安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司，安徽 合肥 230088；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629

WHO 發(fā)布的《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》表明，結(jié)核病仍是全球十大人類死因之一，每年有數(shù)百萬(wàn)人罹患結(jié)核?。?］。新型結(jié)核病預(yù)防體系由初免（primer）策略、初免-加強(qiáng)免疫（primer-boost）策略及潛伏感染人群免疫預(yù)防性治療策略構(gòu)成?？ń槊纾˙acillus Calmette-Guerin vaccine，BCG）是 WHO 推薦唯一可用于預(yù)防結(jié)核病的初免用疫苗［2］。目前，已有若干新候選結(jié)核病疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，但均未取得理想效果［3-4］，因此，BCG 對(duì)結(jié)核的保護(hù)效果成為研究焦點(diǎn)［5-6］。2018年，WHO 立場(chǎng)文件報(bào)告建議進(jìn)行優(yōu)化BCG 接種的研究［2］，其中以 BCG 加強(qiáng)免疫為研究重點(diǎn)［7-8］。

目前，國(guó)內(nèi)已上市的BCG 制品規(guī)格為0.05 mg／人份單一劑量，僅適用于新生兒的初免，加強(qiáng)免疫需研發(fā)安全有效的成人BCG。影響B(tài)CG 保護(hù)力和安全性的最主要因素之一是菌種的選擇，國(guó)際上應(yīng)用較多的BCG 生產(chǎn)用菌種包括法國(guó)巴斯德株（Pasteur 1173 P2）、丹麥 1331 株（Danish 1331）、巴西株（Mearou RJ）、俄羅斯株（Moscow 368）、保加利亞株（Sofia SL222）和日本 172 株（Tokyo-172-1）等，不同 BCG 菌種遺傳特性不同［9］，我國(guó)現(xiàn)用BCG 生產(chǎn)用菌種為D2PB302株。20 世紀(jì) 70年代，DAM 等［10］研究表明，雖然各國(guó)制造BCG 菌株均來(lái)源于法國(guó)巴斯德研究所，但由于當(dāng)初菌株采自混合菌落，菌種存在不均一性，各菌株間的免疫力和毒力均存在差異。在成人BCG 生產(chǎn)用菌種研究過(guò)程中，為克服上述差異，2009年，中國(guó)食品藥品檢定研究院將我國(guó)早期凍干的BCG 菌種進(jìn)行復(fù)蘇并擴(kuò)增傳代，獲得NIFDC 944 株（國(guó)內(nèi)外總計(jì)傳代944 代），2014年以微孔濾膜方式從中獲得目前唯一的1 株BCG 單細(xì)胞克隆菌種NIFDC 945 SⅢ株［11］，該菌株一致性良好。

本研究以BCG 單克隆原始菌種NIFDC 944 株、國(guó)外已上市BCG 的生產(chǎn)株Danish 1331 和國(guó)內(nèi)已上市BCG 的生產(chǎn)株D2PB302 為對(duì)照，通過(guò)脾激活和脾活菌數(shù)試驗(yàn)，檢測(cè)NIFDC 945 SⅢ株菌種免疫效應(yīng)和安全性，以評(píng)價(jià)其作為BCG 候選疫苗株的可行性，為BCG 加強(qiáng)免疫研究的開(kāi)展提供臨床前研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 BCG 單克隆原始菌種NIFDC 944 株、BCG 單細(xì)胞克隆菌種NIFDC 945 SⅢ株、國(guó)外已上市BCG 的生產(chǎn)株Danish 1331 和國(guó)內(nèi)已上市BCG的生產(chǎn)株D2PB302 均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 主要試劑 羅氏雞蛋培養(yǎng)基及穩(wěn)定劑由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備；0.9%氯化鈉（500 mL ／ 瓶）購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) BALB ／ c 小鼠，150 只，雌性，體重16 ~ 20 g，4 ~ 5 周齡，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（蘇）2012-0004。小鼠于安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，每籠6 只，每周換窩3 次，自由取食和飲水。本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（批準(zhǔn)文號(hào)為：皖智龍生藥［2016］9 號(hào)）。

1.4 BCG 菌液的制備 將BCG NIFDC 944 株、NIFDC 945 SⅢ株、Danish 1331 株、D2PB302 株按相同條件分別復(fù)蘇至羅氏雞蛋培養(yǎng)基上［12］，于37 ~39 ℃條件下培養(yǎng)2 ~ 3 周，收集羅氏雞蛋培養(yǎng)基培養(yǎng)物，加入無(wú)致敏源穩(wěn)定劑，稀釋為2 mg ／ mL 的菌懸液，即為BCG 菌液。

1.5 動(dòng)物分組及給藥 將150 只小鼠隨機(jī)分為5 組：BCGNIFDC944、BCGNIFDC 945 SⅢ、BCG Danish 1331、BCG D2PB302 及對(duì)照組，每組30 只。前4 組免疫劑量均為 1 mg ／（0.5 mL·只），對(duì)照組按 0.5 mL ／ 只免疫0.9%氯化鈉溶液，均經(jīng)尾靜脈注射。

1.6 各組小鼠脾激活指數(shù)的檢測(cè) 分別于免疫后24 h 及 1、3、6、9、12 周，每組各取 5 只小鼠，稱量體重，斷頸處死，無(wú)菌取出脾臟，稱量脾重，按下式計(jì)算脾激活指數(shù)。

1.7 各組小鼠脾內(nèi)BCG 存活率的檢測(cè) 于免疫后24 h及 1、3、6、9、12 周，每組各取 5 只小鼠，無(wú)菌取脾臟，整塊置研磨器中，加入3 mL 0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行研磨，制備成脾細(xì)胞懸液，取0.5 mL，用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行10 倍系列稀釋，制備成3 種不同濃度（100、10-1、10-2倍稀釋）的脾菌懸液，接種至羅氏培養(yǎng)基，0.1 mL ／ 支，各組均設(shè) 3 支，于 37 ~ 39 ℃靜置培養(yǎng)4 周后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并按下式計(jì)算小鼠脾內(nèi)存活率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用多重 t 檢驗(yàn)，以 P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的脾激活指數(shù) NIFDC 945 SⅢ、NIFDC 944、D2PB302、Danish 1331 組小鼠免疫后 12 周內(nèi)的脾激活指數(shù)均 ＞2，變化趨勢(shì)相似，1 ~ 3 周脾激活指數(shù)逐漸增加，3 周時(shí)均達(dá)最大值，3 ~ 12 周均有不同程度下降。

3 和 6 周時(shí)，NIFDC 945SⅢ組小鼠脾激活指數(shù)顯著低于 NIFDC 944 組（t 分別為3.025 和 5.003，P 分別為 0.004 和 0.000）；免疫后 1、3、6、9、12 周，NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾激活指數(shù)顯著低于Danish 1331 組（t 分別為 4.211、4.200、4.170、2.223、3.338，P 分別為 0.000、0.000、0.000、0.030、0.001），免疫后24 h 及 1、3、6、9、12 周，NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾激活指數(shù)與D2PB302 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為0.421 4、0.557 2、1.281 0、0.067 4、0.516 9、0.354 9，P 分別為 0.675、0.580、0.205、0.947、0.607、0.724）。免疫后24 h，NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾激活指數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.648，P=0.105）；免疫后 1、3、6、9、12 周，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t 分別為 8.316、26.29、12.30、10.29、8.377，P 均 <0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫不同BCG 菌種小鼠的脾激活指數(shù)Fig.1 Spleen activation indexes of mice immunized with various BCG strains

2.2 各組小鼠脾內(nèi)BCG 的存活率 免疫后12 周內(nèi)，各組小鼠脾內(nèi)BCG 存活數(shù)呈逐步下降趨勢(shì)。NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾內(nèi) BCG 存活數(shù)于免疫后 3、6、9、12 周明顯低于 NIFDC 944 組（t 分別為 13.44、5.955、6.976、3.400，P 均 <0.01），免疫后 1~12 周明顯低于 Danish 1331 組（t 分別為 3.821、5.232、4.049、14.57、3.046，P 均 <0.05），免疫后 1、3、9 周明顯低于 D2PB302 組（t 分別為 3.466、3.555、4.327，P 均 <0.01），見(jiàn)表 1。

表1 免疫不同 BCG 菌株后小鼠脾內(nèi) BCG 的活菌數(shù)（lgCFU ／ mL，，n = 5）Tab 1.Viable counts in spleens of mice immunized with various BCG strains（lgCFU ／ mL，，n = 5）

表1 免疫不同 BCG 菌株后小鼠脾內(nèi) BCG 的活菌數(shù)（lgCFU ／ mL，，n = 5）Tab 1.Viable counts in spleens of mice immunized with various BCG strains（lgCFU ／ mL，，n = 5）

注：aa 表示與 NIFDC 944 SⅢ組比較，P < 0.01；b 表示與 Danish 1331 組比較，P < 0.05；cc 表示與 D2 PB302 組比較，P < 0.01。

組別 免疫時(shí)間24 h 1 周 3 周 6 周 9 周 12 周NIFDC 945 SⅢ組 6.00 ± 0.19 6.58 ± 0.34b，cc 5.79 ± 0.13aa，b，cc 4.67 ± 0.22aa，b 3.74 ± 0.15aa，b，cc 4.29 ± 0.24aa，b NIFDC 944 組 5.85 ± 0.15 6.47 ± 0.38 6.74 ± 0.10 5.19 ± 0.13 4.51 ± 0.23 4.73 ± 0.19 Danish 1331 組 6.77 ± 0.06 5.93 ± 0.17 6.86 ± 0.39 5.08 ± 0.14 4.85 ± 0.12 4.78 ± 0.28 D2 PB302 組 6.48 ± 0.04 5.98 ± 0.10 6.38 ± 0.14 4.40 ± 0.25 4.35 ± 0.34 4.18 ± 0.43對(duì)照組 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00組別

免疫后12 周內(nèi)，各組小鼠脾內(nèi)BCG 存活率呈逐步下降趨勢(shì)，9 ~ 12 周趨于穩(wěn)定。免疫后1 周，NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾內(nèi)BCG 存活率與NIFDC 944組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.304 4，P=0.762）；免疫后 3、6、9、12 周，NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾內(nèi) BCG存活率顯著低于 NIFDC 944 組（t 分別為 7.649、5.346、6.105、4.419，P 分別 <0.001、0.000、<0.001、0.000）。免疫后1 周，NIFDC 945 SⅢ組小鼠脾內(nèi)BCG 存活率顯著高于 Danish 1331 組和 D2PB302 組（t 分別為9.190 和 5.835，P 均 < 0.001）；免疫后 3 和 9 周時(shí)，NIFDC 945 SⅢ組顯著低于 Danish 1331 株（t 分別為2.338 和 3.904，P 分別為0.024 和 0.000）；免疫后 6 和 12 周，NIFDC 945 SⅢ組顯著高于 D2PB302 組（t 分別為 3.844 和 2.988，P 分別為 0.000 和 0.005）。見(jiàn)圖2。

圖2 小鼠免疫不同BCG 菌株后脾內(nèi)BCG 的存活率Fig.2 Viable rates of BCG in spleens of mice immunized with various strains

3 討 論

目前，國(guó)外BCG 加強(qiáng)免疫的臨床研究已取得較大進(jìn)展［7-8］，國(guó)內(nèi)對(duì)結(jié)核菌素陰性青少年及成人接種BCG 的保護(hù)效果相關(guān)研究較少。DARRAH 等［13］研究表明，采用靜脈注射BCG，可顯著增強(qiáng)動(dòng)物血液、脾臟、支氣管肺泡灌洗液和肺淋巴結(jié)中誘導(dǎo)的CD4+和CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答。因此，進(jìn)行BCG 不同菌種的脾激活試驗(yàn)研究可對(duì)該菌種BCG 的免疫力評(píng)價(jià)起到一定預(yù)示作用。BCG 免疫小鼠后脾內(nèi)存活率是BCG菌種的重要生物學(xué)特性之一，BCG 脾內(nèi)存活率與相應(yīng)菌種免疫原性（PPD 皮試陽(yáng)轉(zhuǎn)率）和剩余毒力（淋巴結(jié)不良反應(yīng)等）密切相關(guān)。

本研究用不同BCG 菌株在相同條件下制備菌懸液，免疫小鼠 24 h 及 1、3、6、9、12 周后，比較單細(xì)胞克隆菌株BCG NIFDC 945 SⅢ與其原始菌株NIFDC 944、已上市BCG 的生產(chǎn)株Danish 1331 和D2PB302在小鼠脾激活指數(shù)和脾內(nèi)存活率指標(biāo)上存在的差異。結(jié)果顯示，免疫后12 周，各組小鼠脾中BCG 存活率為64.40%~80.91%；免疫后1~3 周，4 株BCG感染小鼠的脾激活指數(shù)逐漸增加，均＞2，免疫后3周達(dá)最高，隨后雖有降低，但在免疫后12 周時(shí)仍保持較高，與相關(guān)免疫類菌苗脾激活試驗(yàn)脾指數(shù)水平要求相當(dāng)，即BCG 在脾內(nèi)定植，通過(guò)不同程度的生長(zhǎng)繁殖引起脾激活指數(shù)增加，可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答［14］。BCG 單細(xì)胞克隆 NIFDC 945 SⅢ在脾內(nèi)生長(zhǎng)繁殖能力弱于其原始菌株NIFDC 944 株，該菌株免疫力與D2PB302 株相當(dāng)，但低于Danish 1331 株，在脾內(nèi)定植能力弱于Danish 1331 株，強(qiáng)于D2PB302 株。BCG 在宿主內(nèi)的定植能力與毒力具有相關(guān)性［15-16］，本研究表明，BCG NIFDC 945 SⅢ單細(xì)胞克隆株的毒力遠(yuǎn)低于NIFDC 944 株、介于已上市兩種BCG 生產(chǎn)株之間，在產(chǎn)生顯著細(xì)胞免疫效應(yīng)的同時(shí)，可與適宜毒力達(dá)到平衡，且采用單細(xì)胞純化方式建立，因此，可能為BCG 保護(hù)力達(dá)到一致提供一種創(chuàng)新性方法，可作為BCG 候選疫苗株。綜上所述，采用單細(xì)胞純化方式建立的BCG NIFDC 945 SⅢ單細(xì)胞克隆菌種，可能為BCG 保持保護(hù)力一致提供一種創(chuàng)新性方法，由該菌種生產(chǎn)的BCG 已獲得藥物臨床試驗(yàn)批件，但該菌種生產(chǎn)BCG 的保護(hù)力及安全性仍需通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究進(jìn)行進(jìn)一步研究。