PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉穩(wěn)定性及安全性

劉曉琳，李漂，張茜，楊艾，魯衛(wèi)東

昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

疫苗水針劑需在冷鏈中分發(fā)及存儲(chǔ)［1］，運(yùn)輸成本大，物流復(fù)雜，易引起疫苗變質(zhì)等問題。普通脂質(zhì)體的磷脂成分融合、聚集會(huì)導(dǎo)致包封藥物的滲漏和脂質(zhì)體的溶解［2-3］，而PEG 分子較高的柔順性可形成致密的構(gòu)象云，有效地覆在膜表面，阻止脂質(zhì)體相互融合聚集，使其修飾的脂質(zhì)體在體內(nèi)外穩(wěn)定性良好，并能減弱血漿成分對其的破壞或識(shí)別及吸附作用，延長血液循環(huán)半衰期，提高靶向效率，增強(qiáng)藥物療效，降低毒副作用［4-6］。

本實(shí)驗(yàn)采用凍融凍干法制備PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉，并在物理穩(wěn)定性、生物穩(wěn)定性、急性毒性、長期毒性方面進(jìn)行穩(wěn)定性及安全性考察。

1 材料與方法

1.1 流感疫苗原液 H1N1（SA201800，血凝素含量：225.0 μg ／ mL）、H3N2（SB2018002，血凝素含量：166.5 μg ／ mL）、B（V）（SC2018001，血凝素含量：369.1 μg ／ mL）、B（Y）（SC22018006，血凝素含量：326.1 μg ／ mL）均由江蘇沃森生物技術(shù)公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級昆明小鼠，5 周齡，體重18 ～22 g，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2015-0002。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對昆明種小鼠進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且通過昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)的倫理審查。

1.3 主要試劑及儀器 大豆卵磷脂PC-50 購自北京美亞斯磷脂技術(shù)公司；膽固醇、Folin-酚蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；相對分子質(zhì)量 3 000 的 PEG 購自美國 Sigma 公司；RDE-Ⅱ購自日本生研株式會(huì)社；YP-TSD 型三箱式藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱購自上海邁捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XT-2001型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀購自日本Sysmex 公司；LEICAEG1160 一體式石蠟包埋機(jī)、LEICARM2235 手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)和LEICADM4000B 光學(xué)顯微鏡購自德國徠卡儀器有限公司；PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀購自常州市中威電子儀器有限公司等。

1.4 四價(jià)流感疫苗的配制 將4 個(gè)單價(jià)流感疫苗按比例稀釋：H1N1 稀釋 6.25 倍、H3N2 稀釋 4.63 倍、B（V）稀釋 10.25 倍、B（Y）稀釋 9.06 倍，使每個(gè)單價(jià)流感疫苗的血凝素含量為36 μg ／ mL，然后將各單價(jià)流感疫苗混合形成36 μg ／ mL 的四價(jià)流感疫苗原液。

1.5 脂質(zhì)體制備 采用凍融凍干法［7］。取膽固醇80 mg 和大豆卵磷脂300 mg 溶于無水乙醇，溶解后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至成膜狀態(tài)后加入PBS 緩沖液（或含PEG-3000 的 PBS）30 mL，50 ℃水化旋轉(zhuǎn)，間歇超聲，50 ℃水浴孵育，取出冷卻至常溫；四價(jià)流感疫苗原液和脂質(zhì)體混懸液按1.4 ∶1 混合，形成流感疫苗脂質(zhì)體混懸液，-40 ℃凍融 2 次，0.06 mbar，-52 ℃下冷凍干燥28 h 即得中性脂質(zhì)體流感疫苗（或PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗）凍干粉。其中空白脂質(zhì)體不含疫苗原液。

1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.6.1 物理穩(wěn)定性 將PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗混懸液、凍干粉分別儲(chǔ)存于 4、（25 ± 2）、（37 ±2）℃［8］條件下，于第 0、1、2、6月取樣，4 ℃，42 500 × g離心 1 h。Lowry 法檢測包封率［9］。

1.6.2 生物穩(wěn)定性 將PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉分別儲(chǔ)存于4、（25 ± 2）℃條件下，原液始終儲(chǔ)存于4 ℃。于第1、2、3月取樣，腹腔免疫（6 μg 血凝素）小鼠，7 d 后經(jīng)小鼠眼球采血，分離血清。微量血凝抑制法檢測免疫后與免疫前抗體滴度比［10］，評價(jià)其生物穩(wěn)定性。

1.7 安全性試驗(yàn)

1.7.1 急性毒性試驗(yàn)

1.7.1.1 分組及給藥 取小鼠80 只，雌雄各半（雌雄小鼠分別觀察），隨機(jī)分為PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉組（PEG 組）、原液組、脂質(zhì)體組（佐劑組）、PBS 組（陰性對照組），每組 20 只。PBS 復(fù)溶凍干粉。給藥前稱重，PEG 組和原液組小鼠每只腹腔給予最大劑量0.325 mL（15 μg 血凝素，2.5倍正常用量）［11］，佐劑組和陰性對照組小鼠每只腹腔給予同體積空白脂質(zhì)體和PBS。

1.7.1.2 一般臨床觀察 給藥前、給藥4 h 內(nèi)觀察小鼠行為活動(dòng)、外觀體征（外觀、對刺激的反應(yīng)、分泌物、排泄物等）以及中毒反應(yīng)癥狀和程度等，隨后連續(xù)14 d 觀察其一般狀態(tài)及動(dòng)物體重變化。

1.7.2 長期毒性試驗(yàn)

1.7.2.1 分組及給藥 分組同1.7.1.1 項(xiàng)。給藥前稱重，分別在第 0、14 和 28 天分 3 次腹腔給藥（6 μg血凝素）。

1.7.2.2 一般臨床觀察 給藥前觀察1 次，給藥后持續(xù)觀察1 h，其余每天上下午各觀察1 次，恢復(fù)期每天觀察1 次。觀察項(xiàng)目同1.7.1.2 項(xiàng)。

1.7.2.3 體重及攝食量變化 每周稱重1 次，計(jì)算各組小鼠平均體重，觀察體重變化情況；每周稱各籠剩余糧食1 次，計(jì)算每周平均攝食量。

1.7.2.4 血液學(xué)指標(biāo)檢測 末次接種后和恢復(fù)期結(jié)束后經(jīng)小鼠眼球采血，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測血常規(guī)，血液學(xué)指標(biāo)正常值參考文獻(xiàn)［12］。

1.7.2.5 組織解剖及病理學(xué)檢查 恢復(fù)期結(jié)束后，稱重，處死小鼠，剖檢后，肉眼觀察各臟器、器官組織是否異常；稱取臟器重量，計(jì)算臟器系數(shù)；將組織置10%甲醛溶液固定，經(jīng)切片、HE 染色后，鏡檢。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用雙尾分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為0.05，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示［13］。以 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 物理穩(wěn)定性 PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉包封率明顯高于混懸液，（37 ± 2）℃下放置6 個(gè)月，混懸液包封率急劇下降，而凍干粉包封率緩慢下降，表明凍干粉穩(wěn)定性較好。見表1。

表1 PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗包封率（%）Tab.1 Encapsulation efficiency of PEG3000 modified liposome influenza vaccine（%）

2.2 生物穩(wěn)定性 PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉免疫后與免疫前抗體滴度比明顯高于中性脂質(zhì)體，低于疫苗原液，表明凍干粉在（25 ± 2）℃條件下保存3 個(gè)月，生物穩(wěn)定性較好。見表2。

表2 PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉免疫后與免疫前抗體滴度比Tab.2 Antibody titer ratio of PEG3000 modified liposome influenza vaccine in a form of freeze-dried powder after and before immunization

2.3 急性毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)期間小鼠精神狀態(tài)良好，行為活動(dòng)、外觀體征均無異常，體重增加正常，未出現(xiàn)明顯的與疫苗相關(guān)的異常癥狀。

2.4 長期毒性試驗(yàn)

2.4.1 一般臨床觀察 觀察期內(nèi)各組小鼠全部存活，行為活動(dòng)、外觀體征和注射部位均無異?，F(xiàn)象，一般狀況良好。

2.4.2 體重及攝食量 體重均呈增長狀態(tài)，PEG 組、佐劑組、原液組與同期陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 3.12，P ＞ 0.05），見圖 1。試驗(yàn)期間，各組小鼠攝食量未見與給藥相關(guān)的明顯異常。

圖1 雌性（A）和雄性（B）小鼠長期毒性體重的變化Fig.1 Changes of bodyweights of female（A）and male（B）mice in long-term toxicity test

2.4.3 血常規(guī) 與同期同性別陰性對照組比較，原液組雌性小鼠末次接種后血小板數(shù)較恢復(fù)期明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 4.88，P ＜ 0.05），原液組和PEG 組雌性小鼠末次接種后白細(xì)胞數(shù)均較恢復(fù)期降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 3.24，P ＜ 0.05）。各組間檢測指標(biāo)均有一定波動(dòng)，但均在正常范圍內(nèi)變化，且變化幅度未見明顯異常，表明PEG 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉對小鼠機(jī)體血常規(guī)指標(biāo)無不良影響。見表3。

表3 小鼠血液學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果（，n = 5）Tab.3 Test results of hematological indexes of mice（，n = 5）

表3 小鼠血液學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果（，n = 5）Tab.3 Test results of hematological indexes of mice（，n = 5）

檢測時(shí)間 指標(biāo) 性別 PEG 組 佐劑組 原液組 陰性對照組末次給藥 血紅蛋白含量（g ／ L） 雌 156.67 ± 0.94 154.60 ± 3.77 159.00 ± 5.76 152 3 d 后 雄 140.33 ± 27.13 172.80 ± 6.43 163.20 ± 2.79 168血小板數(shù)（× 109 個(gè) ／ L） 雌 732.00 ± 111.63 633.80 ± 156.77 784.80 ± 171.88 488雄 673.67 ± 166.79 619.40 ± 183.60 816.60 ± 293.27 743白細(xì)胞（× 109 個(gè) ／ L） 雌 2.27 ± 0.46 3.64 ± 0.43 2.74 ± 0.98 5.5雄 3.53 ± 1.38 3.40 ± 0.75 4.80 ± 0.30 2.2淋巴細(xì)胞絕對值（× 109 個(gè) ／ L） 雌 2.07 ± 0.39 2.86 ± 0.32 2.36 ± 0.82 4.3雄 2.67 ± 1.13 2.84 ± 0.65 3.98 ± 0.12 1.7恢復(fù)期 血紅蛋白含量（g ／ L） 雌 161.33 ± 5.73 152.80 ± 7.22 150.40 ± 7.58 157.00 ± 6.04結(jié)束 雄 160.00 ± 1.63 162.80 ± 6.40 134.80 ± 13.54 157.60 ± 5.00血小板數(shù)（× 109 個(gè) ／ L） 雌 615.67 ± 31.12 457.40 ± 58.18 519.40 ± 53.55 554.25 ± 107.00雄 555.67 ± 81.71 531.00 ± 56.89 597.20 ± 102.89 547.20 ± 76.34白細(xì)胞（× 109 個(gè) ／ L） 雌 6.10 ± 0.45 4.74 ± 2.11 4.44 ± 1.58 1.80 ± 0.67雄 3.97 ± 1.16 2.78 ± 0.96 4.32 ± 0.56 2.96 ± 0.46淋巴細(xì)胞絕對值（× 109 個(gè) ／ L） 雌 5.03 ± 0.37 3.98 ± 1.79 3.86 ± 1.27 1.50 ± 0.47雄 2.90 ± 1.08 2.14 ± 0.71 3.20 ± 0.25 2.54 ± 0.39

2.4.4 臟器系數(shù)及病理性學(xué)觀察 與同期同性別陰性對照組比較，原液組和PEG 組小鼠脾臟指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 1.89，P ＜ 0.05），且原液組大于PEG 組，PEG 組、原液組釋放血凝素刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，機(jī)體淋巴系統(tǒng)活躍，使脾臟增大。各組小鼠其余臟器重量及臟器系數(shù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.67，P ＞0.05）。見表4。各實(shí)驗(yàn)組末次給藥3 d 后及恢復(fù)期結(jié)束后，各組織均未見與給藥相關(guān)的病理學(xué)改變，見圖2（以部分組織為代表）。

圖2 組織病理學(xué)觀察（HE 染色，× 200）Fig.2 Histopathological observation（HE staining，× 200）

表4 小鼠臟器系數(shù)（，n = 5）Tab.4 Organ coefficients of mice（，n = 5）

表4 小鼠臟器系數(shù)（，n = 5）Tab.4 Organ coefficients of mice（，n = 5）

檢測時(shí)間 臟器 性別 PEG 組 佐劑組 原液組 陰性對照組末次給藥3 d 后 心 雌 0.55 ± 0.07 0.57 ± 0.05 0.50 ± 0.03 0.54 ± 0.08雄0.57 ± 0.08 0.55 ± 0.04 0.52 ± 0.04 0.55 ± 0.03脾臟 雌 0.33 ± 0.06 0.33 ± 0.08 0.43 ± 0.12 0.29 ± 0.04雄0.29 ± 0.04 0.23 ± 0.03 0.32 ± 0.08 0.22 ± 0.02肺臟 雌 0.92 ± 0.37 0.99 ± 0.22 0.90 ± 0.29 0.37 ± 0.05雄0.98 ± 0.30 0.77 ± 0.27 0.69 ± 0.16 0.31 ± 0.07胸腺 雌 0.55 ± 0.07 0.35 ± 0.09 0.37 ± 0.05 0.35 ± 0.05雄0.22 ± 0.05 0.25 ± 0.07 0.31 ± 0.07 0.23 ± 0.09腦雌1.45 ± 0.15 1.34 ± 0.06 1.32 ± 0.08 1.46 ± 0.04雄1.04 ± 0.05 1.20 ± 0.07 1.19 ± 0.11 1.19 ± 0.06恢復(fù)期結(jié)束 心 雌 0.47 ± 0.02 0.51 ± 0.03 0.52 ± 0.04 0.57 ± 0.02雄0.50 ± 0.03 0.49 ± 0.03 0.50 ± 0.04 0.52 ± 0.02脾臟 雌 0.30 ± 0.07 0.27 ± 0.06 0.35 ± 0.04 0.36 ± 0.11雄0.33 ± 0.15 0.23 ± 0.06 0.55 ± 0.21 0.23 ± 0.03肺臟 雌 0.62 ± 0.04 0.70 ± 0.06 0.74 ± 0.16 0.63 ± 0.05雄0.61 ± 0.07 0.72 ± 0.24 0.67 ± 0.16 0.61 ± 0.08胸腺 雌 0.34 ± 0.04 0.37 ± 0.06 0.45 ± 0.13 0.33 ± 0.07雄0.15 ± 0.04 0.23 ± 0.13 0.15 ± 0.06 0.23 ± 0.05腦雌1.27 ± 0.06 1.33 ± 0.08 1.34 ± 0.10 1.41 ± 0.07雄1.09 ± 0.03 1.07 ± 0.06 1.08 ± 0.10 1.07 ± 0.05

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同儲(chǔ)存條件下，PEG3000修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉包封率明顯高于混懸液，且在（25 ± 2）℃條件下儲(chǔ)存 3 個(gè)月，仍能產(chǎn)生良好的體液免疫效應(yīng)，表明凍干粉具有良好的穩(wěn)定性，可緩解冷鏈運(yùn)輸壓力，降低成本。

本實(shí)驗(yàn)通過急性毒性試驗(yàn)和重復(fù)多次給藥的長期毒性試驗(yàn)，評估了臨床試驗(yàn)可能發(fā)生的不良反應(yīng)。結(jié)果顯示，急性毒性試驗(yàn)條件下，腹腔免疫小鼠，注射部位均未出現(xiàn)肉眼可見的刺激性反應(yīng)和異常病理改變。長期毒性試驗(yàn)期間，各實(shí)驗(yàn)組臨床觀察均未見與藥物相關(guān)的異常反應(yīng)；小鼠體重、攝食量均未見與給藥相關(guān)的規(guī)律性改變；組織病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)病變；血液學(xué)檢測結(jié)果顯示，疫苗制品在小鼠體內(nèi)引起了較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體造血系統(tǒng)，導(dǎo)致造血功能增強(qiáng)。根據(jù)白細(xì)胞數(shù)值來看，機(jī)體產(chǎn)生了一定的炎癥反應(yīng)，但均在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，表明炎癥反應(yīng)較輕。由于小鼠的性別差異和代謝特征會(huì)影響免疫系統(tǒng)功能，從而誘發(fā)雌、雄小鼠產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答。雌性小鼠可產(chǎn)生雌激素刺激B 淋巴細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生，免疫應(yīng)答更強(qiáng)烈。血常規(guī)指標(biāo)有一定波動(dòng)，但均在正常值范圍內(nèi)，表明脂質(zhì)體制劑對于小鼠血常規(guī)指標(biāo)無不良影響。綜上所述，PEG3000 修飾的脂質(zhì)體流感疫苗凍干粉急性毒性和長期毒性試驗(yàn)均未見明顯毒性反應(yīng)，初步證實(shí)該疫苗具有良好的安全性。