新規(guī)格凍干甲型肝炎減毒活疫苗的免疫原性及安全性評價

徐艷玲，王藝博，侯麗娟，李勇，岳立廣，夏青娟，申文晉，張春云，范明源，劉令九，鄒勇

1.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長春 130012；2.天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津300301

甲型肝炎（簡稱甲肝）是由甲肝病毒引起的一類高發(fā)病率的病毒性傳染病［1］，嚴(yán)重危害人類健康，全球每年報告發(fā)病約20 萬例，主要暴發(fā)于衛(wèi)生條件和社會經(jīng)濟(jì)條件較差的發(fā)展中國家［2-4］，也有報道顯示，在衛(wèi)生條件和衛(wèi)生習(xí)慣較差的發(fā)達(dá)國家，20% ~25%的肝炎病例與甲肝有關(guān)［5］。甲肝較少致命，感染嚴(yán)重程度通常隨著年齡的增長而增加，僅有少于1%的甲肝患者，特別是老年或患有慢性肝病的患者發(fā)生死亡，2016年，經(jīng) WHO 統(tǒng)計，全球有 7 000 多人死于甲肝［6-7］。WHO 推薦預(yù)防甲肝的最有效方法是接種甲肝疫苗［8］。我國是甲肝流行較嚴(yán)重的國家之一，具有較高的發(fā)病率及感染率，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和甲肝疫苗的應(yīng)用，甲肝的發(fā)病率和感染率已明顯下降［9-10］，但在中西部地區(qū)，甲肝發(fā)病率仍較高，因此甲肝的預(yù)防仍不容忽視［11-13］。

長春生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的凍干甲型肝炎減毒活疫苗（L-A-1 減毒株，簡稱甲肝減毒活疫苗）每劑復(fù)溶后為1.0 mL，該規(guī)格已上市應(yīng)用近20年，具有良好的安全性和免疫效果［14］。2008年，凍干甲型肝炎減毒活疫苗納入國家免疫規(guī)劃，接種對象為18 個月齡以上的兒童。國家計劃免疫一類疫苗（包括糖丸及其他劑型）中，規(guī)格為每劑0.5 mL的疫苗有15 個，占比58%，表明0.5 mL 規(guī)格的疫苗是計劃免疫中疫苗發(fā)展的趨勢，更有利于計劃免疫的接種和實施。因此，長春生物制品研究所有限責(zé)任公司優(yōu)化了甲肝減毒活疫苗穩(wěn)定劑配方，將疫苗規(guī)格由復(fù)溶后每劑1.0 mL 變更為0.5 mL。本研究對變更后的甲肝減毒活疫苗的免疫原性和安全性進(jìn)行評價，為該疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原液及疫苗 復(fù)溶后為每劑0.5 mL 的甲肝減毒活疫苗試驗疫苗（于-60 ℃以下保存，各項檢測指標(biāo)均合格，批號為：S20140301、S20140302、S20140303）及復(fù)溶后每瓶1.0 mL 的市售甲肝減毒活疫苗（批號為：20140723、20140724、20140725）均由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 甲型肝炎病毒抗原檢測試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司；牛血清白蛋白ELISA 定量檢測試劑盒購自無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司；甲型肝炎病毒抗體診斷試劑盒購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；氣相色譜儀（型號：G1530A）購自安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗動物 SPF 級 NIH 小鼠，雌雄各半，3 ～ 4周齡，體重14 ～16 g，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司動物室提供，動物許可證號為：SCKK（吉）-2011-0003；SPF 級 SD 大鼠，雌雄各半，5 ～ 6 周齡，體重145 ～173 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號為：11400700116922；普通級日本大耳白家兔，雌雄各半，體重2.095 ～2.665 kg，12 ～20 周齡，購自北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心，動物合格證號為：11401400000676。本實驗對動物的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.4 免疫原性試驗 將NIH 小鼠隨機(jī)分為8 組，每組20 只（雌雄各半）。其中6 組分別注射批號為S2014-0301、S20140302、S20140303 的試驗疫苗及批號為20140723、20140724、20140725 的市售疫苗，免疫劑量分別為0.5 和1.0 mL／只，同時設(shè)陰性對照組（0.9%氯化鈉，0.5 mL ／ 只）及空白對照（不作任何處理）。各組小鼠均經(jīng)腹腔免疫，免疫28 d 后經(jīng)心臟采血，分離血清，用甲肝病毒抗體診斷試劑盒檢測血清中甲型肝炎病毒抗體滴度。取抗體滴度以2 為底數(shù)的對數(shù)，計算各組的抗體幾何平均滴度及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 急性毒性試驗 將SD 大鼠隨機(jī)分為3 組，每組20 只（雌雄各半）。其中2 組分別注射試驗疫苗（批號為：S20150814）及市售疫苗（批號為：20140723），注射體積分別為1 和2 mL ／ 只，均經(jīng)背部2 點皮下注射，每點相應(yīng)分別注射0.5 和1.0 mL ／ 劑，同時設(shè)陰性對照組（0.9%氯化鈉溶液，注射劑量及途徑同試驗疫苗）。給藥后每日觀察大鼠毒性反應(yīng)情況，共觀察28 d，記錄每組動物死亡情況。于給藥前及給藥后 1、3、7、14、21、28 d 稱重，觀察體重變化。在試驗過程中發(fā)生死亡和瀕死的動物應(yīng)及時進(jìn)行解剖檢查，給藥后28 d 對所有存活大鼠均進(jìn)行大體剖檢。

1.6 刺激性試驗

1.6.1 動物分組及給藥 將18 只家兔隨機(jī)分為3組，每組6 只（雌雄各半）。其中2 組分別注射試驗疫苗（批號為：S20150814）及市售疫苗（批號為：2014-0723），均經(jīng)背部皮下注射，注射體積分別為0.5 和1.0 mL ／（劑·只），同時設(shè)陰性對照組（0.9%氯化鈉溶液，經(jīng)背部皮下注射，0.5 mL ／ 只）。

1.6.2 體重檢測 于給藥前及給藥后3、4、23 d 稱量各組家兔體重，觀察體重變化。

1.6.3 皮膚刺激反應(yīng)評分 于給藥前及給藥后24、48、72 h，觀察家兔的反應(yīng)及注射部位皮膚的刺激反應(yīng)，對注射部位皮膚（外觀）按紅斑（無紅斑、勉強(qiáng)可見、明顯可見、中度至嚴(yán)重紅斑、紫紅色紅斑并有焦痂形成的分值分別為 0、1、2、3、4 分）和水腫［無水腫、勉強(qiáng)可見、可見（邊緣高出周圍皮膚）、皮膚隆起約1 mm 且輪廓清楚、水腫隆起1 mm 以上且范圍擴(kuò)大的分值分別為 0、1、2、3、4 分］情況進(jìn)行評分。計算各時間點的反應(yīng)分值均值，≤2 判為符合規(guī)定，＞2判為不符合規(guī)定。

1.6.4 解剖及組織病理學(xué)檢查 于給藥后4 d（每組隨機(jī)取3 只家兔）及23 d（每組剩余3 只家兔）剖檢，取背部給藥部位及其周圍的皮膚和肌肉。觀察注射部位皮膚、皮下組織及肌肉的刺激反應(yīng)，計算每個劑量組給藥部位刺激反應(yīng)級數(shù)的平均分值，無明顯變化、輕度（充血范圍在0.5 cm×1.0 cm 以下）、中度（充血范圍在 0.5 cm × 1.0 cm 以上）、重度（充血伴有肌肉變性）、出現(xiàn)壞死有褐色變性、出現(xiàn)肌肉嚴(yán)重變性及廣泛性壞死的分值分別為 0、1、2、3、4、5 分。同時，將剖檢樣品經(jīng)固定、脫水及石蠟包埋等處理后，進(jìn)行3 μm 厚度切片，HE 染色，顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗數(shù)據(jù)采用均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析和t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫原性試驗 3 批試驗疫苗和市售疫苗免疫后，小鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，陰性對照及空白對照陽轉(zhuǎn)率均為0。批號為S20140301、S20140302、S20140303 的試驗疫苗及批號為 20140723、2014-0724、20140725 的市售疫苗組小鼠血清抗體平均滴度分別為 8.88 ± 0.65、8.88 ± 0.55、8.57 ± 0.54、8.28 ± 0.69、8.88 ± 0.67、8.57 ± 0.59，試驗疫苗組與市售疫苗組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.208，P ＞ 0.05）。

2.2 急性毒性試驗

2.2.1 體重 給藥后28 d 觀察期內(nèi)各組均未見大鼠死亡及其他異常反應(yīng)。與給藥前比較，給藥后1、3、7、14、21 和 28 d，試驗疫苗組、市售疫苗組、陰性對照組大鼠的平均體重均呈增長趨勢；試驗疫苗組及市售疫苗組大鼠平均體重與同期同性別陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.398 ~ 1.718，P均 ＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體重變化（g，，n = 10）Tab.1 Changes of bodyweights of mice rats in various groups（g，，n = 10）

表1 各組大鼠體重變化（g，，n = 10）Tab.1 Changes of bodyweights of mice rats in various groups（g，，n = 10）

組別 性別 給藥前給藥后時間（d）14 21 28試驗疫苗組 雄 225.0 ± 6.3 235.0 ± 7.5 250.7 ± 9.1 283.0 ± 11.9 332.9 ± 17.7 360.2 ± 34.1 402.5 ± 29.6雌 192.6 ± 6.6 194.7 ± 5.9 204.9 ± 5.8 221.7 ± 7.2 239.2 ± 8.1 253.2 ± 16.4 264.0 ± 17.2市售疫苗組 雄 223.6 ± 8.3 233.9 ± 10.0 250.4 ± 11.7 285.6 ± 14.3 337.4 ± 23.5 380.5 ± 28.5 414.4 ± 36.5雌 195.4 ± 5.8 201.2 ± 6.1 208.4 ± 6.7 223.1 ± 6.8 238.4 ± 16.4 256.3 ± 10.7 271.4 ± 13.0陰性對照組 雄 225.2 ± 8.9 233.9 ± 9.4 253.1 ± 10.2 281.3 ± 9.3 337.5 ± 15.0 377.1 ± 19.9 409.3 ± 23.7雌 194.6 ± 5.6 199.6 ± 8.8 206.3 ± 8.7 224.6 ± 10.4 235.3 ± 16.9 267.6 ± 22.5 278.1 ± 27.5 1 3 7

2.2.2 大體剖檢 各組大鼠毛順、有光澤，營養(yǎng)狀況良好。顱腔內(nèi)未見積水，腦膜未見出血，腦實質(zhì)未見水腫；胸、腹膜光滑，未見黏連；胸、腹腔內(nèi)未見積液；心、肺、腦、肝、腎、脾、胸腺、腎上腺、甲狀腺、胰腺、性腺、胃腸道、淋巴結(jié)等形態(tài)、顏色、位置正常，未見肉眼可見的病理改變。

2.3 刺激性試驗

2.3.1 體重 各組家兔的體重增長范圍正常，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.721 ~ 2.086，P 均 ＞ 0.05），見表2。表明藥物對家兔體重?zé)o影響，且各組家兔均未發(fā)現(xiàn)全身毒性反應(yīng)。

表2 各組家兔的體重變化（g）Tab.2 Changes of bodyweights of rabbits in various groups（g）

2.3.2 皮膚刺激反應(yīng)評分 整個試驗過程中，家兔注射部位皮膚肉眼觀察未見充血、紅腫等刺激反應(yīng)，各檢測時間點皮膚刺激反應(yīng)評分結(jié)果（紅斑 ／ 水腫）均為0。

2.3.3 解剖及組織病理學(xué)檢查 各組家兔給藥后4和23 d，注射部位皮膚及周圍組織均未見注射部位皮下組織的刺激反應(yīng)（如充血、壞死等），評分均為0。鏡下檢查顯示，給藥后4 和23 d，各組家兔的皮膚、皮下及肌肉各層結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，間質(zhì)未見異常，見圖1 ～ 圖3。

圖1 試驗疫苗組家兔注射部位皮下組織病理切片的鏡下觀察（HE 染色，× 40）Fig.1 Microscopy of pathological section of subcutaneous tissue in injection site of rabbits immunized with test vaccine（HE staining，× 40）

圖2 市售疫苗組家兔注射部位皮下組織病理切片的鏡下觀察（HE 染色，× 40）Fig.2 Microscopy of pathological section of subcutaneous tissue in injection site of rabbits immunized with commercial vaccine（HE staining，× 40）

圖3 陰性對照組家兔注射部位皮下組織病理切片的鏡下觀察（HE 染色，× 40）Fig.3 Microscopy of pathological section of subcutaneous tissue in injection site of rabbits in negative control group（HE staining，× 40）

3 討 論

2008年，甲型肝炎疫苗被列入國家計劃免疫，甲肝減毒活疫苗因其價格低廉、免疫效果好及1 針接種的優(yōu)勢［15］，被列入國家采購計劃。同時，隨著國家對疫苗管理標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，改進(jìn)生產(chǎn)工藝、提升產(chǎn)品質(zhì)量、提高市場競爭力已成為生產(chǎn)企業(yè)的重要需求。

減小疫苗成品規(guī)格是未來疫苗的發(fā)展趨勢，也是疫苗質(zhì)量提升的關(guān)鍵。在確保疫苗有效性和安全性不變的前提下，將甲肝減毒活疫苗的規(guī)格由復(fù)溶后1.0 mL ／ 劑變更為復(fù)溶后 0.5 mL ／ 劑，其主要優(yōu)勢在于能夠減輕嬰幼兒接種時的疼痛感，有利于計劃免疫的推廣和應(yīng)用。本實驗結(jié)果表明，3 批新規(guī)格的甲肝減毒活疫苗（復(fù)溶后0.5 mL ／ 劑）試驗疫苗和市售甲肝減毒活疫苗（復(fù)溶后1.0 mL ／ 劑）小鼠血清抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，且兩者抗體平均滴度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），表明兩者的免疫原性效果相當(dāng)。刺激性試驗結(jié)果表明，兩種疫苗組均未見毒性反應(yīng)，表明新規(guī)格的甲肝減毒活疫苗具有良好的免疫原性和安全性。本研究為新規(guī)格甲肝減毒活疫苗的進(jìn)一步應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。