鼻黏膜給藥裝置中5 種抗氧劑提取方法的建立及其在鼻噴流感減毒活疫苗中的遷移

修華謙，邵宏秋，李景新，張全順，李吉，李晶晶，鄒鑫，施歌，張鳳吉，付沛林，石亮

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.長春百克生物科技股份公司，吉林 長春 130000；3.吉林省藥品監(jiān)督管理局長春檢查分局，吉林 長春 130000；4.沈陽唯隆旺醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 沈陽 110000

隨著藥品包材、藥用輔料與藥品關(guān)聯(lián)審評政策的逐步實施，對藥品包材變更進(jìn)行相容性研究和評估顯得尤為重要。《藥品管理法》中明確指出，直接接觸藥品的包裝材料和容器，應(yīng)符合藥用要求及保障人體健康、安全的標(biāo)準(zhǔn)［1］。藥品包裝應(yīng)滿足藥品預(yù)期目的的適用性要求。適用性包括保護(hù)性、功能性、安全性和相容性［2］。藥品與其直接接觸的包裝系統(tǒng)滿足相容性要求，是保證藥品質(zhì)量安全必須具備的條件之一。相容性研究是證明包裝材料與藥品之間未發(fā)生嚴(yán)重的相互作用，并導(dǎo)致藥品有效性和穩(wěn)定性發(fā)生改變，或產(chǎn)生安全性風(fēng)險的過程，研究內(nèi)容包括包裝材料或組件的可提取研究、藥品與包裝系統(tǒng)接觸的浸出研究及可能產(chǎn)生的對藥品和輔料活性成分的吸附研究［3-4］。

藥品包裝對于保證藥物穩(wěn)定性起著重要作用，因此將直接影響藥品使用的安全性。目前市售疫苗直接接觸的包材主要有西林瓶、膠塞、預(yù)灌封注射器，材質(zhì)主要為玻璃和彈性體密封件，其中膠塞（即彈性體密封件）的配方中含有多種添加劑，如抗氧劑，工藝加工過程中的抗氧劑可能會不同程度地向藥品中遷移，且添加劑及其降解物有一定毒性，均造成了包材的安全隱患［5］。

鼻黏膜給藥裝置（膠塞、鼻噴裝置）各組件成分信息較復(fù)雜，為防止有毒有害物質(zhì)向鼻噴流感減毒活疫苗中遷移，也為確保藥品上市后的安全性和有效性等，必須對二者開展相容性研。本文旨在研究鼻黏膜給藥裝置膠塞和鼻噴裝置中5 種抗氧劑的提取及其在鼻噴流感減毒活疫苗中的遷移，以分析疫苗與鼻黏膜給藥裝置之間的相容性［6］。

1 材料與方法

1.1 樣品 鼻黏膜給藥裝置用氯化丁基橡膠膠塞（批號：0182469）和鼻噴裝置（批號：0206925）購自美國BD 公司；鼻噴流感減毒活疫苗（批號：CP20210-404、CP20210405、CP20210406，規(guī)格：0.2 mL ／ 支）為長春百克生物科技股份公司產(chǎn)品；對照品抗氧劑3114（批號：A2115328）、330（批號：H2006214）、1076（批號：K2003215）、168（批號：J1816129）購自阿拉丁試劑上海有限公司；抗氧劑1010（批號：C190Q90）購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 乙腈（批號：T0031440，色譜純）和甲醇（批號：I3151440，色譜純）購自德國CNW公司；四氫呋喃（批號：2021012601，色譜純）購自山東省禹王實業(yè)總公司化學(xué)試劑廠；無水乙醇（批號：R142130）購自北京迪科馬科技有限公司；AUW 120 D 電子分析天平購自日本島津公司；MD 20 Hmini微波消解 ／ 萃取儀購自成都奧普樂儀器有限公司；Agilent 1200 高效液相色譜儀和色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）購自美國安捷倫科技公司；固相萃取柱購自Welchrom月旭科技（上海）股份有限公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 對照品溶液

1.3.1.1 3114 對照品 精密稱定抗氧劑3114 對照品60 mg，置10 mL 量瓶中，加甲苯5 mL 使溶解，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為抗氧劑3114 對照品貯備液；量取0.5 mL，置25 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為抗氧劑3114 對照品母液；量取對照品母液1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為抗氧劑3114 對照品溶液［7］。

1.3.1.2 1010 對照品 精密稱定抗氧劑1010 對照品45 mg，按照抗氧劑3114 步驟制備對照品貯備液；量取1 mL，按照抗氧劑3114 步驟制備對照品母液和溶液。

1.3.1.3 330 對照品 精密稱定抗氧劑330 對照品30 mg，按照對照品1010 步驟制備對照品貯備液、母液和溶液。

1.3.1.4 1076 對照品 精密稱定抗氧劑1076 對照品60 mg，按照抗氧劑3114 步驟制備對照品貯備液；量取2 mL，按照抗氧劑3114 步驟制備對照品母液和溶液。

1.3.1.5 168 對照品 精密稱定抗氧劑168 對照品60 mg，按照抗氧劑3114 步驟制備對照品貯備液；量取2.5 mL，按照抗氧劑3114 步驟制備對照品母液和溶液。

1.3.1.6 混合對照品 分別精密量取抗氧劑3114、1010、330、1076、168 對照品母液各 1 mL，置 10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即5 種抗氧劑混合對照品溶液。

1.3.1.7 檢測限及定量限溶液 精密量取5 種抗氧劑混合對照品溶液1 mL，置25 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為5 種抗氧劑靈敏度貯備液，量取2 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為5 種抗氧劑定量限溶液。精密量取5 種抗氧劑靈敏度貯備液1 mL，置10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為5 種抗氧劑檢測限溶液。

1.3.1.8 線性溶液 分別精密量取抗氧劑3114、1010、1076 對照品貯備液 0.5、1、2 mL，置 25 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為線性母液。分別量取線性母液 0.2、0.5、1、2、3、4 mL 至 10 mL 量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，分別作為線性溶液。

1.3.2 供試品溶液

1.3.2.1 供試品溶液1 取剪碎的膠塞約2 g，精密稱定，置微波萃取罐中，加入甲苯-甲醇（2 ∶3）溶液10 mL，加蓋密封，置微波消解儀內(nèi)100 ℃微波萃取30 min，冷卻后，萃取液經(jīng) 0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液 1［8］。

1.3.2.2 供試品溶液2 取鼻噴流感減毒活疫苗，精密量取1 mL，用固相萃取柱萃?。ㄝ腿≈R用前分別用甲醇4 mL 及水4 mL 活化），用50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液2。

1.3.2.3 供試品溶液3 取剪碎的膠塞3 份各約2 g，精密稱定，置微波萃取罐中，分別加入線性母液0.8、1、1.2 mL，再分別加入甲苯 ∶甲醇（2 ∶3）溶液9.2、9、8.8 mL，加蓋密封，置微波消解儀內(nèi) 100 ℃微波萃取30 min，冷卻后，萃取液經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別作為80%供試品溶液3、100%供試品溶液3、120%供試品溶液3。每個濃度平行制備3 份。

1.3.2.4 供試品溶液4 精密量取鼻噴流感減毒活疫苗3 份各1 mL，分別加入線性母液0.8、1、1.2 mL，用固相萃取柱萃取，用50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，定容至 10 mL，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，分別作為 80%供試品溶液 4、100%供試品溶液4、120%供試品溶液4。每個濃度平行制備3 份。

1.3.2.5 供試品溶液5 取剪碎的膠塞約2 g，精密稱定，置微波萃取罐中，加入3 種抗氧劑檢測限貯備液 1 mL，再加入甲苯：甲醇（2 ∶3）溶液至 10 mL，置微波消解儀內(nèi)100 ℃微波萃取30 min，冷卻至室溫，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，作為膠塞加標(biāo)溶液。

1.3.2.6 供試品溶液6 取鼻噴流感減毒活疫苗，精密量取1 mL，加入2 種抗氧劑檢測限貯備液1 mL，用固相萃取柱萃?。ㄝ腿≈R用前分別用甲醇4 mL及水4 mL 活化），用50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，作為鼻噴流感減毒活疫苗加標(biāo)溶液。

1.3.2.7 供試品溶液7 取剪碎的鼻噴裝置約2 g，精密稱定，置微波萃取罐中，精密加入甲苯-甲醇（2 ∶3）溶液10 mL，加蓋密封，置微波消解儀內(nèi)100 ℃微波萃取30 min，冷卻后，萃取液經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液7。

1.3.2.8 供試品溶液8 取鼻噴流感減毒活疫苗若干支，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，40 ℃放置48 h，冷卻后，精密量取1 mL，用固相萃取柱萃取，用50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，定容至10 mL，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為鼻噴流感減毒活疫苗模擬提取溶液。

1.4 膠塞、鼻噴裝置中抗氧劑的提取 考慮藥液的pH值、離子強(qiáng)度、極性等因素，以及膠塞、鼻噴裝置的配方，根據(jù)添加劑與溶劑極性相似相溶的原理，選擇藥液本身以及有機(jī)溶劑，并采取加熱回流和微波萃取的方式，對膠塞、鼻噴裝置中的抗氧劑（3114、1010、330、1076、168）進(jìn)行提取，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）考察 5 種抗氧劑在膠塞、鼻噴裝置中的含量［6］，色譜條件：使用 ZORBAX SB-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）色譜柱，流動相：乙腈-四氫呋喃（6 ∶3）-水（9 ∶1），柱溫：40 ℃，波長：280 nm，流速：1.5 mL / min，進(jìn)樣量：10 μL［8］。

1.5 膠塞、鼻噴裝置中抗氧劑的遷移試驗 考察3批鼻噴流感減毒活疫苗在加速［（25 ± 2）℃放置0、5、10 d］和長期穩(wěn)定性（2 ～ 8 ℃放置 3、6 個月）試驗條件下，鼻黏膜給藥裝置膠塞、鼻噴裝置中的5 種抗氧劑（3114、1010、330、1076、168）遷移進(jìn)入鼻噴流感減毒活疫苗中的情況［9］。

1.6 安全性評估 根據(jù)提取試驗可提取物5 種抗氧劑的含量是否低于其分析評價閾值（analysis and evaluation threshold，AET），評價可提取物的安全風(fēng)險，通過每日藥品最大攝入量（0.2 mL），計算有害成分的最大攝入量，并與有害成分的人每日允許攝入量（permitted daily exposure，PDE）進(jìn)行比較，評價其安全性［10-12］。根據(jù)膠塞、護(hù)帽中可提取物遷移試驗結(jié)果，由添加劑的未觀測到效應(yīng)水平（no observed effect level，NOEL）值計算其 PDE 值，評估鼻噴流感減毒活疫苗與鼻黏膜給藥裝置直接接觸的安全性［13-16］。

1.7 方法的驗證

1.7.1 專屬性 取空白溶劑、樣品溶液、對照品溶液，通過HPLC 測定分析，記錄色譜圖。研究各目標(biāo)物的色譜峰是否受空白溶劑、包材、藥液基質(zhì)的干擾，記錄各目標(biāo)峰的保留時間［17］。

1.7.2 檢測限和定量限 取檢測限及定量限溶液，通過HPLC 測定分析，以3 倍信噪比峰強(qiáng)度所對應(yīng)對照品溶液的濃度為檢測限；以10 倍信噪比峰強(qiáng)度所對應(yīng)對照品溶液的濃度為定量限。

1.7.3 線性與范圍 分別取6 個濃度的抗氧劑3114、1010、1076 線性溶液，通過 HPLC 測定分析，記錄相應(yīng)的峰面積，以線性溶液的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性方程，并計算相關(guān)系數(shù)（r），r 應(yīng) ≥ 0.999［18］。

1.7.4 重復(fù)性 參考供試品溶液的配制方法，平行配制6 份，通過HPLC 測定分析，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。5 種抗氧劑檢測結(jié)果的RSD 應(yīng)≤4%。

1.7.5 準(zhǔn)確性 各平行配制3 種加標(biāo)濃度的供試品溶液，同一濃度平行制備3 份，同時制備3 份未加混合標(biāo)準(zhǔn)母液的空白溶液，通過HPLC 測試分析，并計算5 種抗氧劑的回收率［19］?；厥章蕬?yīng)在85% ~110%范圍內(nèi)。

2 結(jié) 果

2.1 膠塞、鼻噴裝置中抗氧劑的含量 提取試驗結(jié)果表明，膠塞中檢出抗氧劑3114 和1076，未檢出其他3 種抗氧劑；鼻噴裝置中檢出抗氧劑3114、1010和1076，未檢出其他2 種抗氧劑。符合《歐洲藥典》對5 種抗氧劑的限度要求。見表1、圖1 ～圖3。

表1 膠塞、鼻噴裝置中 5 種抗氧劑含量（μg ／ g）Tab.1 Contents of five kinds of antioxidants in rubber stoppers and nasal mucosal drug delivery device（μg ／ g）

圖1 5 種抗氧劑混合對照品圖譜Fig.1 Mixed reference substance map of five kinds of antioxidants

圖2 膠塞中抗氧劑3114（左峰）和1076（右峰）圖譜Fig.2 Spectrum of antioxidants 3114（left peak）and 1076（right peak）in rubber stoppers

圖3 鼻噴裝置中抗氧劑3114（左峰）、1010（中峰）和1076（右峰）圖譜Fig.3 Spectrum of antioxidants 3114（left peak），1010（middle peak）and 1076 （right peak）in nasal mucosal drug delivery device

2.2 膠塞、鼻噴裝置中抗氧劑的遷移 3 批鼻噴流感減毒活疫苗在加速和長期穩(wěn)定性試驗條件下，均未檢出5 種抗氧劑，見圖4。

圖4 遷移試驗中5 種抗氧劑檢測的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC profile of five antioxidants in migration test

2.3 安全性評估 根據(jù)提取試驗和遷移試驗結(jié)果可知，藥液中不含5 種抗氧劑或測定結(jié)果低于儀器的檢測限，從材料的安全角度出發(fā)，藥品中可能含有的抗氧劑以儀器的檢測限計，即抗氧劑3114、1010、330、1076、168 的檢測限分別為 0.047 8、0.070 6、0.047 8、0.188 4 和 0.235 6 μg ／ mL。5 種抗氧劑的日最大攝入量均小于各PDE，且儀器的檢測限濃度小于AET，方法靈敏度滿足AET 的測定要求，對患者的安全性風(fēng)險較小。見表2。

表2 5 種抗氧劑含量Tab.2 Contents of five kinds of antioxidants

2.4 方法的驗證

2.4.1 專屬性 試驗結(jié)果顯示，空白溶劑與其他成分對5 種抗氧劑檢測無干擾，表明方法專屬性良好。

2.4.2 檢測限和定量限 抗氧劑3114、1010、330、1076、168 的檢測限分別為 0.047 8、0.070 6、0.047 8、0.188 4、0.235 6 μg ／ mL；定量限分別為 0.095 6、0.141 2、0.095 6、0.376 9、0.471 3 μg ／ mL。

2.4.3 線性與范圍 抗氧劑3114 在濃度2.390 3 ～47.805 4 μg ／ mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為 y = 1.673 6 x + 0.229 6（r = 0.999 9）；抗氧劑1010 在濃度 3.529 6 ～ 70.591 4 μg ／ mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為y = 2.166 4 x + 0.286 3（r = 0.999 9）；抗氧劑 1076 在濃度 9.422 5 ～188.449 3 μg ／ mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性方程為 y = 1.264 6 x + 0.431 4（r = 0.999 9）。見圖 5。

圖5 抗氧劑 3114（A）、1010（B）、1076（C）含量測定線性關(guān)系圖Fig.5 Linear relationship diagram for determination of contents of antioxidants 3114（A），1010（B）and 1076（C）

2.4.4 重復(fù)性 鼻噴流感減毒活疫苗中未檢出抗氧劑3114、1010 和 1076；膠塞中檢出抗氧劑 3114和1076，其含量檢測結(jié)果的RSD 分別為0.9%和1.0%，未檢出抗氧劑1010。表明該方法重復(fù)性良好。見表3。

表3 膠塞中抗氧劑 3114 和 1076 含量重復(fù)檢測結(jié)果（μg ／ g）Tab.3 Repeat test results of contents of antioxidants 3114 and 1076 in rubber stoppers（μg ／ g）

2.4.5 準(zhǔn)確性 膠塞中抗氧劑 3114、1010、1076 的平均回收率分別為100.5%、98.7%和96.6%；鼻噴流感減毒活疫苗中抗氧劑3114、1010、1076 的平均回收率分別為95.5%、95.7%和97.0%。表明該方法準(zhǔn)確性較高。

3 討 論

本研究建立了5 種抗氧劑的提取方法，采用HPLC法可精準(zhǔn)檢測5 種抗氧劑在鼻黏膜給藥裝置膠塞和鼻噴裝置中的含量，以及在鼻噴流感減毒活疫苗中的遷移量。通過專屬性、檢測限、定量限、線性、重復(fù)性、準(zhǔn)確性驗證，表明通過此方法可獲得準(zhǔn)確、可靠的5 種抗氧劑含量，為抗氧劑遷移入藥品的安全性評估提供了依據(jù)。同時，此方法簡單方便，可為此類包材相容性研究提供一種有效、準(zhǔn)確的檢測方法，可用于遷移試驗中抗氧劑的含量測定。

本研究發(fā)現(xiàn)，膠塞中檢出抗氧劑3114 和1076，未檢出其他3 種抗氧劑，鼻噴裝置中檢出抗氧劑3114、1010 和 1076，未檢出其他 2 種抗氧劑，符合《歐洲藥典》對5 種抗氧劑的限度要求。鼻噴流感減毒活疫苗在加速0、3、6 個月，長期6 個月穩(wěn)定性試驗條件下，均未檢出5 種抗氧劑。通過5 種抗氧劑的提取和遷移試驗研究，表明鼻噴流感減毒活疫苗與鼻黏膜給藥裝置相容性良好。