血清總膽紅素重氮鹽法和釩酸鹽氧化法測定方法的比較

郭晶晶 孟超 劉茜

摘要：膽紅素是血紅蛋白的代謝產(chǎn)物，主要涉及肝臟代謝，血清膽紅素水平是肝膽疾病的重要診斷指標。體內(nèi)的膽紅素包括直接膽紅素、間接膽紅素，二者之和稱為總膽紅素，臨床對膽紅素的生化檢測有多種方法，本文使用重氮鹽法和釩酸鹽法對血清總膽紅素進行測定，比較兩種方法檢測結果的差異。實驗結果發(fā)現(xiàn)，兩種方法的重復性和準確度均能滿足臨床要求，釩酸鹽法的準確度高于重氮鹽法。

關鍵詞：膽紅素代謝 ?膽紅素測定方法 ?重氮鹽法 ?釩酸鹽法 ?方法比較

肝臟是人體最大的實質(zhì)性器官，具有復雜而重要的生理功能，參與代謝是肝臟最主要的功能。肝臟參與三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程：肝臟可以合成蛋白質(zhì)，亦可以分解蛋白質(zhì)。人體有超過40%的蛋白質(zhì)是在肝臟合成的，血漿白蛋白則完全由肝臟合成。肝臟細胞含有蛋白質(zhì)脫氨酶和轉氨酶，從而分解蛋白質(zhì)，氨進一步轉變成尿素排泄。人體攝入的糖類在肝臟轉變?yōu)槠咸烟牵斞菨舛壬邥r，血糖可轉變成葡萄糖聚合物以糖原的形式貯存于肝臟，當血糖濃度降低時，肝糖原可以迅速分解成葡萄糖，向人體供能，從而保持血糖的穩(wěn)定。當人體攝入的糖類物質(zhì)較少時，肝臟可以將氨基酸、丙酮酸等非糖類物質(zhì)轉變成肝糖原，以滿足機體對葡萄糖的消耗。肝臟可以合成膽固醇，膽固醇轉變成膽汁酸鹽，膽汁酸鹽使脂肪乳化成微粒，脂肪微?？杀簧眢w吸收。脂類物質(zhì)可直接與肝臟中的蛋白質(zhì)結合成脂蛋白。肝臟參與維生素的代謝。一些脂溶性維生素可長期大量儲存于肝臟中，如維生素A、維生素D、維生素B12的儲存量可滿足幾個月甚至是一兩年的使用。肝臟中可形成有多種凝血因子，如凝血因子I。同時，肝臟可形成抗凝血因子，如肝素。因為肝臟的體積大，可以貯存的血量多，因此肝臟也是主要的貯血器官[1]。肝臟是已知的最重要的解毒場所，內(nèi)源性毒物，如激素、血氨等，以及外源性毒物，如藥物、毒物等，均可在肝臟轉化，降低毒性或解毒后，隨尿液、膽汁等途徑排出體外。

肝臟的再生和代償能力很強，切除部分肝臟，肝功能不受影響，剩余肝細胞通過再生使肝臟恢復完整。但是肝臟也是很敏感和脆弱的，當肝功能發(fā)生紊亂時，會對人體健康產(chǎn)生各種影響，嚴重者可危害生命。已知多種物質(zhì)均可引起肝功能異常，如酒精、病毒、化學藥物和有毒物質(zhì)，肝細胞損傷后可產(chǎn)生各種肝臟疾病，包括酒精性肝病、慢性病毒性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病等[2]。

血清生化檢查是臨床常用的肝功能檢測項目，包含多種檢測指標，如反映肝細胞損傷的ALT、AST和GGT，反映肝臟合成功能的白蛋白、凝血酶原時間、肝纖維化的透明質(zhì)酸、IV型膠原，以及反映膽紅素代謝的總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素。通過分析生化指標與正常值的偏離程度，有助于對肝臟相關疾病的鑒別診斷及治療藥物和方案的選擇等[3]。

膽紅素主要來源于衰老的紅細胞，其中的血紅蛋白代謝產(chǎn)生，此部分占膽紅素總量的80%左右，其余少量的膽紅素來源于其他含血紅素的蛋白，如肌紅蛋白、細胞色素P450等。血紅蛋白在組織蛋白酶的作用下，分解產(chǎn)生亞鐵血紅素，亞鐵血紅素經(jīng)微粒體酶等作用形成膽綠素，膽綠素經(jīng)膽綠素還原酶作用形成游離膽紅素[4]，即間接膽紅素。

肝臟是膽紅素主要代謝場所，膽紅素的代謝包含多個環(huán)節(jié)，即肝細胞對血液中膽紅素的攝取和轉運，間接膽紅素轉化為直接膽紅素，直接膽紅素經(jīng)膽汁排泄，這一系列的過程相互連接和影響，任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙，均可導致膽紅素的代謝異常[5]。血清膽紅素水平反映了肝臟細胞對膽紅素攝取、結合和排泄的能力。血清膽紅素包括總膽紅素、直接膽紅素和間接膽紅素。當肝功能受損時，肝臟對膽紅素的代謝能力下降，血清膽紅素濃度升高。臨床上將血清膽紅素水平作為肝膽疾病和溶血疾病鑒別診斷的重要指標[6]?？偰懠t素增高，同時直接膽紅素和間接膽紅素也增高，常見于肝細胞性黃疸，如急性黃疸型肝炎、重癥肝炎、慢活肝、肝硬化等疾病。總膽紅素和直接膽紅素升高，常見于阻塞性黃疸，如膽道結石、膽道梗阻等疾病?？偰懠t素和間接膽紅素升高，常見于溶血性黃疸和遺傳性疾病[7]。

臨床對膽紅素的測定有多種方法，目前市面上常見的測定總膽紅素的試劑盒，主要包括兩種方法學，即重氮鹽法和釩酸鹽法。重氮鹽法是最早被發(fā)現(xiàn)使用的，且是全國醫(yī)學檢驗學會推薦的方法，具有較高的靈敏度、準確度和精密度，線性范圍較寬，基本能滿足臨床使用需求，但是重氮法有其局限性，試劑穩(wěn)定性較低，受干擾因素多，溶血對檢測準確度影響尤其嚴重。隨著技術的發(fā)展，多種膽紅素檢測方法被發(fā)現(xiàn)，釩酸鹽法是其中性能比較好且被普遍選擇的一種方法[8]。本文采用了同一家公司生產(chǎn)的兩種方法學的膽紅素測定試劑盒，對膽紅素國家標準物質(zhì)進行測定，對實驗結果進行比較，以此分析兩種方法學對檢測結果的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

北京九強生物技術股份有限公司生產(chǎn)的：總膽紅素測定試劑盒（重氮鹽法）（批號：200326）及配套臨床化學校準血清（批號：190201）和定值多項質(zhì)控血清（批號：190929）;總膽紅素測定試劑盒（釩酸鹽氧化法）（批號：200526）及配套臨床化學校準血清（批號：190201）和定值多項質(zhì)控血清（批號：190929）。中國食品藥品檢定研究院研制的：總膽紅素冰凍人血清國家標準品（批號：360033-201901），水平1：（7.01±0.28）?mol/L和水平2：（27.10±0.54）?mol/L。

1.2 儀器

日立7180型全自動生化分析儀。

1.3 方法

重氮鹽法在7180上主要參數(shù)如下。主波長：546 nm，副波長：660 nm，試劑1量：160 ?L，試劑2量：40 ?L，樣品量：8 ?L，方法：2 point end。釩酸鹽法在7180上主要參數(shù)：主波長：450 nm，副波長：546 nm，試劑1量：224 ?L，試劑2量：56 ?L，樣品量：8 ?L，方法：2 point end。使用臨床化學校準血清校準儀器，測定定值多項質(zhì)控血清，質(zhì)控測定值符合要求后，測試樣本?？偰懠t素冰凍人血清國家標準品兩個濃度水平，避光恢復至室溫后，取適量用于測定，每個水平各測定10次。BE7B49A7-BB89-4384-B0BD-08972D762372

2 實驗結果

2.1 準確度實驗

測定結果的平均值（X）與標準品靶值的相對偏差（RD），如表1所示。

實驗結果顯示，重氮鹽法測定結果與標準品靶值的相對偏差均大于±10%，釩酸鹽法測定結果與標準品靶值的相對偏差均小于±5%，說明釩酸鹽法的準確度更好。

2.2 重復性實驗

測定結果的平均值（X）、變異系數(shù)（CV），如表2所示：

實驗結果表明，兩種方法測定的精密度良好，CV均小于10%，兩種方法測定水平2的CV均小于水平1，說明高濃度樣本相對于低濃度樣本，受到的干擾更小，因此精密度更好。

3 討論

隨著科技的發(fā)展和技術的進步，臨床檢測水平不斷提升，不僅是檢測儀器更加智能化、自動化和高通量化，檢測試劑也逐步變得更為精準、快捷、無毒和高效，同時為了適應市場競爭，試劑成本也需要不斷降低。

本次實驗采用的是北京九強生物技術股份有限公司生產(chǎn)的兩種試劑盒。重氮鹽法的檢驗原理為：在酸性條件下，膽紅素與重氮化二氯苯胺發(fā)生偶聯(lián)反應，生成有色偶氮化合物，其生成量與總膽紅素的濃度成正比，偶氮化合物在中性溶液中呈現(xiàn)紅色，在酸性和堿性溶液中呈現(xiàn)藍色[9]。釩酸鹽法的檢驗原理為：在pH值為3的條件下，界面活性劑與釩酸作用，將樣本中的總膽紅素氧化成膽綠素，由此測定釩酸作用前后的吸光度差，并與已知濃度的標準溶液比較，從而計算出樣本中膽紅素的濃度[10]。

本次實驗分別用重氮鹽法和釩酸鹽法對血清總膽紅素進行了準確度實驗和精密度實驗。

準確度實驗結果顯示，兩個濃度水平的樣本測量中，重氮鹽法測定結果與樣本靶值的相對偏差均大于10%，但是小于15%，釩酸鹽法測定結果與樣本靶值的相對偏差均小于5%，說明釩酸鹽法的準確度高于重氮鹽法，能更好地適用于臨床使用。精密度實驗結果顯示，兩種方法測定結果的變異系數(shù)均小于10%;兩個濃度水平的樣本測量中，重氮鹽法的變異系數(shù)均小于釩酸鹽法;兩個濃度水平的樣本測量結果進行比較，高濃度樣本的變異系數(shù)均小于低濃度樣本。說明兩種方法的精密度良好，均能滿足臨床試驗的要求，重氮鹽法的精密度高于釩酸鹽法，高濃度樣本的精密度高于低濃度樣本。

重氮鹽法在測定臨床樣本時，受到的干擾因素較多，如溶血、脂血、黃疸等因素對測定結果影響大[11]，因此臨床使用范圍較窄。釩酸鹽法不受樣本溶血、脂血因素的影響，因此臨床使用范圍廣，且測定結果更能反映真實的濃度。重氮鹽法試劑長期穩(wěn)定性較差，已知北京九強生物技術股份有限公司生產(chǎn)的兩種試劑盒均使用疊氮鈉作為防腐劑，而疊氮鈉可能破壞偶氮試劑，從而影響重氮反應[12]，使實驗結果數(shù)據(jù)偏離真實值。釩酸鹽法的試劑更穩(wěn)定，且雙試劑可直接使用，操作簡單，適合臨床上全自動生化分析儀的操作。北京九強生物技術股份有限公司生產(chǎn)的兩種試劑盒，重氮鹽法的線性區(qū)間為3.0～513.0 ?mol/L，釩酸鹽法的線性區(qū)間為3.0～684.0 ?mol/L，可知釩酸鹽法的線性范圍更廣，臨床適用范圍廣泛。

4 結語

肝臟是人體重要的器官，參與人體多種物質(zhì)的代謝，包括三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，同時肝臟是人體最重要的解毒器官，內(nèi)源性和外源性毒物均需要在肝臟代謝轉化成無毒物質(zhì)后排泄。如果肝臟出現(xiàn)問題，肝臟所參與的各種物質(zhì)的代謝過程均可能出現(xiàn)紊亂，從而對人體健康產(chǎn)生危害，甚至危及生命。臨床對肝功能評價包括多種指標，主要是血清生化檢測指標，其中檢測膽紅素水平可反映肝臟對膽紅素代謝的能力。人體內(nèi)膽紅素有兩種存在形式，即直接膽紅素和間接膽紅素，二者之和為總膽紅素。肝臟是膽紅素的主要代謝場所，包括肝細胞對膽紅素的攝取、轉運和排泄等一系列的過程。當肝功能受損時，肝臟對膽紅素的代謝能力下降，血清中膽紅素水平升高。臨床對膽紅素測定有多種方法，其中重氮鹽法是最早被發(fā)現(xiàn)使用的，但是其受溶血等影響較大，線性范圍較窄，且試劑穩(wěn)定性較差，臨床使用具有一定的局限性。隨著技術的發(fā)展，多種膽紅素檢測方法被發(fā)現(xiàn)，其中釩酸鹽氧化法因具有多種的優(yōu)越性而被普遍接受。本文對重氮鹽法和釩酸鹽氧化法檢測血清總膽紅素進行比較，實驗結果發(fā)現(xiàn)兩種方法均具有較好的重復性和準確性，其中釩酸鹽氧化法的準確度高于重氮鹽法。

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