3 種尼泊金酯類防腐劑對發(fā)光菌Q67 聯合毒性相互作用的定量評估

周娜娜, 張瑾 , 曹家樂, 馬添翼, 鮑立寧

安徽建筑大學環(huán)境與能源工程學院,安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室,合肥 230601

尼泊金酯類防腐劑被廣泛用于化妝品、食品等領域,其對環(huán)境和人體健康的影響頗受關注[1-3]。 大約1932年尼泊金酯就已經開始被廣泛用作各類食品制造中的防腐劑,到1965年,人們逐步意識到尼泊金酯有防腐劑功能,而后又將其廣泛應用于食品、飲料、化妝品、家具和皮革等各類日用化工產品中[4-6]。 美國食品藥品管理局認定尼泊金酯是一種普通安全性成分,被人體腸胃及皮膚細胞吸收后,可在體內進行水解并伴隨著尿液而排出。 然而,因其致敏反應及潛在的老化肌膚風險,尼泊金酯安全性引起了諸多爭論。 目前,在我國的醫(yī)藥和化妝品健康環(huán)境保護規(guī)范中,尼泊金酯類的防腐劑在所有醫(yī)藥和化妝品中單一酯的最大限量為0.4%,混合酯的限量為0.8%,過量的使用有可能直接引起嚴重的皮膚感染[7-8]。 di Poi 等[9]發(fā)現尼泊金酯類防腐劑對婦女具有潛在的內分泌干擾效應,可以直接模擬婦女的雌激素作用,與男性精子DNA 的損傷之間呈負相關,從而嚴重影響男性的生殖機能,并且還有可能與婦女乳腺癌的發(fā)病和形成等有一定的聯系。 汪博林[10]研究發(fā)現,尼泊金乙酯會增加大型溞(Daphnia magna)的死亡率。 閆小雨等[11]發(fā)現尼泊金丙酯對魚體有一定的毒性作用,且會破壞魚體內鈉鉀泵的離子轉運功能。 因此,考察尼泊金酯類防腐劑對水體的污染和影響具有重要的環(huán)境意義。

尼泊金酯類防腐劑通常以混合物的形式存在于環(huán)境中,混合物的聯合毒性相互作用與單個化合物的毒性作用不同,甚至對環(huán)境的毒害作用更大[12-14]。因此,研究尼泊金酯類防腐劑混合物的毒性及其相互作用具有重要意義。 王滔等[15]研究了苯嗪草酮、草凈津和特丁通的3 種二元混合體系對蛋白核小球藻的毒性相互作用隨著暴露時間和混合物濃度的變化,由加和作用向協同作用轉變。 黃子晏等[16]采用絕對殘差模型(deviation from CA model, dCA)定量評估重金屬鉛和農藥甲霜靈、草甘膦三元混合體系對青?；【?Vibrio qinghaiensissp. -Q67, Q67)的拮抗作用強度。 因此,采用dCA 值表征毒性相互作用強度在評估環(huán)境污染物風險時具有一定的意義,并且將暴露時間和化合物的濃度相結合更具有一定的現實意義。

綜上所述,本文擬以3 種尼泊金酯類防腐劑尼泊金甲酯(methylparaben, MET)、尼泊金乙酯(ethylparaben, ETH)和尼泊金丙酯(propylparaben, PRO)為研究對象,應用直接均分射線法(direct equipartition ray, EquRay)和均勻設計射線法(uniform design ray, UD-Ray),分別設計3 種尼泊金酯類防腐劑的3個二元混合體系(MET-ETH、MET-PRO、ETH-PRO)和一個三元混合物體系(MET-ETH-PRO),每個混合體系分別設計5 條不同濃度配比的射線(R1、R2、R3、R4 和R5),以發(fā)光菌Q67 為指示性生物,采用時間微板毒性分析法(t-MTA),測定5個暴露時間(0.25、2、4、8 和 12 h)Q67 的發(fā)光值。 使用濃度加和(concentration addition, CA)模型和dCA 模型進行混合物間的毒性相互作用的定性與定量分析,從而為尼泊金酯類防腐劑混合物的毒性研究或生態(tài)風險等研究提供合理的建議。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與儀器

3 種尼泊金酯類防腐劑 MET、ETH 和 PRO,純度均＞99%,均購于國藥集團化學試劑有限公司,其基本性質如表1 所示。 3 種試劑的儲備液均采用蒸餾水配制,儲備于棕色瓶中,保存于4 ℃冰箱中,備用。

表1 3 種防腐劑的分子式、分子量、CAS 號、儲備液以及擬合函數 Weibull 的參數(α、β)、統計學參數(RMSE 和R)、半數效應濃度(EC50)及其負對數值(pEC50)Table 1 The molecular formula, molecular weight, CAS number, stock, fitted parameters(α and β) and statistical parameters (RMSE and R) of fitted function Weibull,median effect concentration (EC50) and its negative logarithm (pEC50) values for three parabens

主要實驗儀器:Synery 2 Multi-Mode 酶標儀(美國伯騰儀器有限公司),JB-CJ-1FX 超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司,中國),FST-TOP-A24普力菲爾超純水機(上海富詩特儀器設備有限公司,中國),YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司,中國),HYC-260 型立式冷藏箱(青島海爾電冰柜有限公司,中國),BS-2H 立式單門雙層恒溫震蕩器(金壇市天竟實驗儀器廠,中國)。

1.2 Q67 的培養(yǎng)

Q67 購買于北京濱松光子技術股份有限公司。將Q67 凍干粉用活化液活化,并置于固體平板中涂布。 涂布完成后將平板置于培養(yǎng)箱中于(22±1) ℃培養(yǎng)24 h,然后將固體平板置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?實驗前接種于液體培養(yǎng)基中并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng),溫度為(22±1) ℃,轉速為 120 r·min-1,待Q67 長到對數期后使用。 其培養(yǎng)基的具體配制方法與實驗操作過程參考文獻的方法[17-18]。

1.3 微板毒性分析法

3 種尼泊金酯類防腐劑及其二元混合體系(MET-ETH、MET-PRO、ETH-PRO)和三元混合體系(MET-ETH-PRO)對 Q67 的毒性測定采用 t-MTA法[19]。 選擇不透明96 孔白板為作實驗載體,在其四周共36個微孔中加入200 μL 超純水以此來避免邊緣化效應。 在第 6、7、11 列分別加入 100 μL 超純水作為空白對照組,其余列按預實驗的稀釋因子設置12個濃度梯度,最終在每個微孔中加入100 μL 處于對數生長期的Q67 菌液使得每個孔的總體積為200 μL,置于(22±1) ℃培養(yǎng)箱中,在暴露時間分別為 0.25、2、4、8 和 12 h 時取出,用酶標儀測定 Q67的發(fā)光值數據。 為減少實驗誤差,每個實驗組均設置3個平行樣。 具體過程詳見參考文獻[20]。

1.4 混合物的實驗設計

為有效地考察混合物隨濃度和時間的毒性變化規(guī)律,實驗采用直接均分射線法(EquRay)[21]設計了3個二元混合物體系(MET-ETH、MET-PRO 和ETHPRO),應用均勻設計射線法(UD-Ray)[22]設計了一個三元混合體系(MET-ETH-PRO),每個混合物體系均安排了5 條不同濃度比的射線(R1、R2、R3、R4 和R5),各組分濃度比(pi)如表2 所示。

表2 混合物體系各物質組分濃度比(pi)Table 2 Concentration ratio of each component in mixture system (pi)

1.5 濃度-效應曲線擬合

通常情況下,常用Weibull 函數擬合在不同暴露時間點的S-型濃度-效應關系[19],函數Weibull[19]表達式見公式(1):

式中:E表示效應(0≤E≤1),c表示單一化合物或者混合物濃度,α和β是函數Weibull 公式的參數。

1.6 混合物毒性相互作用分析

1.6.1 濃度加和(CA)模型

CA 模型常用來評估污染間的聯合毒性相互作用[23]。 CA 預測線位于置信區(qū)間內部、上方和下方,分別代表混合物的毒性相互作用為加和作用、拮抗作用和協同作用[24]。 CA 模型公式如下:

式中:ci表示混合物產生某一效應x%時組分i的濃度,ECx,i表示混合物中第i個組分單獨存在時產生效應x%時所需要的濃度。

1.6.2 絕對殘差模型(dCA)

dCA 模型基于CA 模型衍生而來,可用來定量評估混合物體系的聯合毒性作用強弱,dCA＞0、dCA＜0 和dCA=0 時,分別表示拮抗作用、協同作用和加和作用,dCA 的絕對值越小,毒性相互作用越弱[19]。dCA 模型公式如公式(3)所示:

式中:EPRE,CA為CA 預測效應,EOBS為實驗觀測效應。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 3個尼泊金酯類防腐劑對Q67 的毒性

污染物對Q67 在不同暴露時間的濃度-效應數據可以用非線性函數 Weibull 有效擬合(RMSE ＜0.070,R＞0.9700)[19],其中擬合的參數(α和β)和統計學參數(RMSE 和R)如表1 所示。 3 種防腐劑MET、ETH 和PRO 對Q67 在不同暴露時間的濃度-效應觀測值及其非線性擬合結果如圖1 所示。 由圖1 可知,3 種尼泊金酯類防腐劑(MET、ETH 和PRO)均呈現出明顯的“S”型濃度-效應特征,且隨著化合物濃度的增大,抑制率也在增大,即具有濃度依賴毒性。由表1 中的半數效應濃度(EC50)和圖1 可知,MET、ETH 和PRO 3 種防腐劑毒性的時間依賴性均不明顯,即急性毒性和長期毒性無明顯差異,這說明一定濃度的MET、ETH 和PRO 防腐劑在短時間內即可產生明顯的毒性。

圖1 3 種防腐劑對Q67 的濃度-效應圖Fig.1 The concentration-response curves of three parabens on Q67

2.2 3個尼泊金酯類防腐劑二元混合體系對Q67的毒性

3 種尼泊金酯類防腐劑構成的3個二元混合體系(MET-ETH、MET-PRO 和 ETH-PRO)對 Q67 在不同暴露時間的濃度-效應如圖2 所示。 由圖2 可知,3個二元混合體系(MET-ETH、MET-PRO 和 ETHPRO)對Q67 的毒性均呈現出良好的濃度-效應關系,且濃度效應曲線均為“S”型。 隨著混合物體系濃度的增大,3個二元混合體系的抑制率都增大,即毒性均具有濃度依賴性。 此外,隨著暴露時間的延長,3個混合體系中各條射線的毒性在0 ~12 h 有逐漸減小的趨勢,即具有時間依賴性,但METPRO 和ETH-PRO 混合體系的5 條射線比 METETH 混合體系的5 條射線對Q67 的毒性在0 ~12 h 變化明顯。

圖2 3個二元混合物體系在不同暴露時間對Q67 的濃度-效應曲線Fig.2 The concentration-response curves of three binary mixture systems in different time for Q67

混合物組分濃度比依賴毒性已有報道[25]。 以半數效應濃度的負對數(pEC50)值為毒性大小指標,本研究中的3個二元混合體系15 條混合射線在不同暴露時間的pEC50值與組分濃度比(pi)之間具有明顯的線性關系(表3)。 由表3 可知,暴露時間為12 h時,MET-ETH 混合體系的5 條混合物射線的pEC50值與混合物組分MET 的濃度配比均呈負相關關系(R=-0.9477,RMSE=0.0007),與混合物組分ETH 的濃度配比均呈正相關關系(R=0.9477, RMSE =0.0007);MET-PRO 混合體系的5 條混合物射線的pEC50值與混合物組分MET 的濃度配比呈現負相關關系(R=-0.9889, RMSE=0.0003),且與混合物組分PRO 的濃度配比呈現正相關關系(R=0.9889,RMSE=0.0003);ETH-PRO 混合體系的5 條混合物射線的pEC50值與混合物組分ETH 的濃度配比呈現負相關關系(R=-0.9905, RMSE=0.0002),且與混合物組分 PRO 的濃度配比呈現正相關關系(R=0.9905, RMSE=0.0002)。 進一步分析發(fā)現,含有組分MET 的混合物體系的射線毒性與MET 的濃度比負相關,而含有PRO 組分的混合物體系的射線毒性與PRO 的濃度比正相關(表3)。

表3 3個二元混合物體系的毒性(pEC50 值)與組分濃度比(pi)之間的線性關系Table 3 The linear relationship between the toxicity (pEC50) and the component concentration ratio (pi) of three binary mixture systems

2.3 3個尼泊金酯類防腐劑二元混合物的毒性相互作用

采用CA 模型對3個尼泊金酯類防腐劑二元混合物體系(MET-ETH、MET-PRO 和 ETH-PRO)的 15條混合射線的毒性相互作用進行分析,3個混合物體系中具有毒性相互作用(協同作用/拮抗作用)的代表性混合物射線的實驗觀測值及其95%置信區(qū)間、擬合曲線以及CA 預測結果如圖3 ~圖5 所示,其余未列出的混合物射線均為加和作用。

由圖3 ~圖5 可知,3個二元混合物體系的協同或拮抗作用均具有時間依賴性和濃度依賴性。 由圖3 可知,在 MET-ETH 混合體系中,除混合射線 R5在整個暴露時間段內未呈現毒性相互作用外,其余混合射線在8 h 均出現混合射線落在置信區(qū)間的下方,即呈現協同作用,其中在暴露時間4 h 和12 h時,混合射線R2 和R1 的CA 預測線分別位于置信區(qū)間的下方,即呈現協同作用;在暴露時間8 h 時,混合射線(R1 ~R4)在中高濃度區(qū)域均呈現協同作用,其余濃度區(qū)域為加和作用,說明隨著暴露時間的延長和濃度范圍的增大,由加和作用轉變?yōu)閰f同作用。 由圖4 可知,在 MET-PRO 混合體系中,射線R1、R3、R4 和 R5 均出現了拮抗作用,且其拮抗作用都是在長期暴露時間內和中高濃度范圍內呈現。 由圖5 可知,ETH-PRO 混合體系也呈現了毒性相互作用:拮抗作用。 混合射線(R1、R3、R4 和 R5)均出現了拮抗作用,且隨著暴露時間的延長而變化。 隨著暴露時間的延長,射線 R1、R3、R4 和 R5 拮抗作用越來越不明顯,甚至由拮抗作用轉變?yōu)榧雍妥饔谩?/p>

dCA 可用來定量評估混合物體系的毒性相互作用強度[26]。 3個二元混合物體系(MET-ETH、MET-PRO 和 ETH-PRO)的 dCA 變化如圖 6 所示。由圖6 可知,dCA 三維曲面圖的顏色漸變情況可以很明顯地表述出污染物毒性作用,即協同或拮抗作用隨濃度和時間因素的變化規(guī)律,拮抗和協同作用分別采用藍色和紅色表示,隨著拮抗/協同作用的增強,即隨著dCA 絕對值的增大,藍色/紅色越深。 由圖6 可知,3個二元混合物體系dCA 值受暴露時間和混合物濃度的影響。 Zhang 等[27]的研究證明了dCA 曲線的協同效應受暴露時間和混合物濃度的影響。 3個二元混合物體系(MET-ETH、MET-PRO和ETH-PRO)均呈現相同的規(guī)律。 在同一暴露時間點,在低濃度、中濃度區(qū)域藍色/紅色越來越深,dCA絕對值隨著濃度的增加而不斷增大,即拮抗(協同)作用強度在低濃度、中濃度區(qū)域不斷增強。 在高濃度區(qū)域,藍色/紅色先變深后變淺,dCA 絕對值先增后減,即在高濃度區(qū)域拮抗(協同)作用強度先增后減;在同一濃度作用下,藍色/紅色越來越深,dCA 絕對值隨著暴露時間的延長而緩慢增大,即拮抗(協同)作用強度隨著暴露時間的延長而不斷增強。 在MET-ETH 混合體系中,R2 射線的協同作用強度最大,其混合物體系濃度為7.14E-4 mol·L-1,在暴露時間為4 h 時,dCA 絕對值的最大值為0.164;在MET-PRO 混合體系中,R5 射線的拮抗作用強度最大,其混合物體系濃度為6.26E-4 mol·L-1,在暴露時間為12 h 時,dCA 絕對值的最大值為0.380;在ETH-PRO 混合體系中,R2 射線的拮抗作用強度最大,其混合物體系濃度為3.67E-4 mol·L-1,在暴露時間為4 h 時,dCA 絕對值的最大值為0.204。 與圖3、圖 4 和圖 5 的結果比較可知,CA 和 dCA 對 3 種防腐劑的毒性相互作用定性分析結果基本一致,dCA 三維曲面可以直觀且定量地評估污染物毒性相互作用。 因此,dCA 三維曲面圖可以推薦用于客觀評估混合污染物的環(huán)境風險。

圖6 3個二元混合物體系中具有毒性相互作用射線的dCA 三維曲面圖Fig.6 Three dimensional dCA diagram of rays with toxicity interaction in three binary mixtures

2.4 尼泊金酯類防腐劑三元混合體系對Q67 的毒性

MET-ETH-PRO 三元混合體系的毒性數據可用Weibull 函數有效擬合,擬合的時間-濃度效應曲線如圖7 所示。 由圖 7 可知,MET-ETH-PRO 三元混合體系對Q67 的毒性均呈現良好的濃度-效應關系,且濃度效應曲線均為“S”型。 MET-ETH-PRO 三元混合體系共15 條混合射線對Q67 的抑制率隨著混合物體系濃度的增大而增大,說明毒性均隨著混合物體系濃度的增大而增大,即MET-ETH-PRO 三元混合體系的毒性具有濃度依賴性。 MET-ETH-PRO混合體系的 5 條射線(R1、R2、R3、R4 和 R5)隨暴露時間延長,毒性逐漸減弱,即短期毒性(暴露時間為0.25 h)明顯大于長期毒性(暴露時間為12 h),說明MET-ETH-PRO 三元混合體系的毒性具有一定的時間依賴性。 但與二元混合物體系不同,混合物體系的毒性與組分濃度比之間的關系分析結果顯示不具有明顯的線性關系。

圖7 MET-ETH-PRO 混合物體系在不同暴露時間對Q67 的濃度-效應曲線Fig.7 The concentration-response curves of MET-ETH-PRO mixture systems to Q67 in different time

2.5 尼泊金酯類防腐劑三元混合物的聯合毒性相互作用

對MET-ETH-PRO 三元混合物體系采用CA 模型進行毒性相互作用的分析,且采用dCA 值定量評估混合物體系的毒性相互作用強度,圖8 給出了三元混合物體系中具有毒性相互作用的混合物射線的實驗觀測值及其95%置信區(qū)間、擬合曲線以及CA預測結果,其余射線均為加和作用。 由圖8 可知,MET-ETH-PRO 三元混合物體系中共5 條混合射線(R1、R2、R3、R4 和 R5),其中 R1、R2、R3 和 R4 均呈現了毒性相互作用:拮抗作用,且拮抗作用均發(fā)生在高濃度區(qū)域。 混合射線R1、R2 和R3 在暴露時間8~12 h 出現拮抗作用,射線R4 在整個暴露時間段(0.25 ~12 h)均呈現拮抗作用,隨時間延長,拮抗作用趨于明顯。

圖9 為 MET-ETH-PRO 混合體系的 dCA 三維曲面圖。 由圖9 可知,MET-ETH-PRO 三元混合物體系拮抗作用的強度受暴露時間和混合物濃度的雙重影響。 在同一暴露時間點,在低濃度、中濃度區(qū)域藍色變深,dCA 值隨著濃度的增加而不斷增大,在高濃度區(qū)域藍色變淺,即dCA 值先增后減;在同一濃度作用下,藍色越來越深,dCA 值隨著暴露時間的延長而緩慢增大,即拮抗作用越來越明顯。 dCA 值在MET-ETH-PRO 混合體系中,R4 射線的協同作用強度最大,其混合物體系濃度為6.43E-4 mol·L-1,在暴露時間為12 h 時,dCA 絕對值的最大值為0.384。 且 MET-ETH-PRO 三元混合物體系 dCA 絕對值的最大值(0.384)大于3 組二元混合體系的dCA 絕對值的最大值。 以上結果也說明dCA 三維曲面圖不僅可以直觀且可以定量地評估污染物毒性相互作用,可以推薦用于客觀評估混合污染物的環(huán)境風險。

圖9 MET-ETH-PRO 混合物體系中具有毒性相互作用射線的dCA 三維曲圖Fig.9 Three dimensional dCA diagram of rays with toxic interaction in MET-ETH-PRO mixtures

綜上所述,本研究得出:

(1) 3個防腐劑 MET、ETH 和 PRO 對 Q67 的濃度-效應呈現“S”型,且其毒性大小具有濃度依賴性,具有明顯的急性毒性,但不具有明顯的時間依賴性。

(2)3 種防腐劑的二元和三元混合體系對Q67的毒性均具有濃度依賴性,即混合污染物的毒性隨著混合體系的濃度增大而增大,但隨暴露時間的延長毒性逐漸減小;二元混合體系的毒性與組分濃度比呈良好的線性關系,但三元混合體系的毒性與組分濃度比不具有明顯的線性相關性。

(3) CA 和dCA 對3 種防腐劑的毒性相互作用定性分析結果一致,3個二元混合體系(MET-ETH、MET-PRO 和ETH-PRO)均表現出了毒性相互作用,其中MET-ETH 混合體系呈現協同作用,MET-PRO和ETH-PRO 混合體系出現拮抗作用,MET-ETHPRO 三元混合體系呈現拮抗作用,且均具有時間依賴性。

(4) 依據dCA 三維曲面圖,二元和三元混合體系毒性相互作用強度(dCA 絕對值)受暴露時間和混合物濃度的雙重影響。 在二元混合體系中,METPRO-R5 射線在混合物體系濃度為6.26E-4 mol·L-1、暴露時間為12 h 的拮抗作用強度最大,其dCA絕對值的最大值為0.380;在三元混合體系METETH-PRO 中,R4 射線在混合物體系濃度為6.34E-4 mol·L-1、暴露時間為12 h 時的協同作用強度最大,其dCA 絕對值的最大值為0.384。

(5) dCA 三維曲面圖可以直觀且可以定量地評估污染物毒性相互作用,可以用于客觀評估混合污染物的環(huán)境風險。