增塑劑DEHP 神經(jīng)毒性作用及機制的研究進展

王婷, 高星梅, 郭會彩, 劉詣,* , 王磊

1. 河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院,石家莊 050017

2. 河北省環(huán)境與人群健康重點實驗室,石家莊 050017

3. 河北醫(yī)科大學藥學院,石家莊 050017

鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate, DEHP) 作為一種鄰苯二甲酸酯類(phthalates, PAEs)增塑劑,在日常生活中最為常見。由于其本身可以聚合產(chǎn)品以增加塑料分子的柔韌性和延展性,因而被添加到許多食品及飲水的包裝、玩具、醫(yī)療器械等產(chǎn)品中[1]。 但DEHP 與這些塑料制品是以非共價鍵范德華力結合,因此極易在加工、運輸和使用過程中釋放并進入環(huán)境介質之中[2-3],最終可通過不同途徑,例如經(jīng)口、皮膚和注射等進入機體,對人體和野生動物產(chǎn)生終生暴露的風險,這引起了人們對其安全性及對人體健康的潛在影響的擔憂。

目前發(fā)現(xiàn),水果蔬菜、乳制品、魚和肉等食物中都含有DEHP[4]。 一般人群可以通過吸入空氣、攝入食物和水接觸DEHP,其中飲食是主要暴露途徑[5]。除去非飲食攝入、醫(yī)療和職業(yè)暴露外,普通人群其他來源 DEHP 每日暴露值估計在 3 ~30 μg·kg-1[6]。兒童因吮吸或咀嚼塑料制品而接觸DEHP 的每日暴露值可能達到85 μg·kg-1[7],此值已超過了美國環(huán)境保護局(US EPA)規(guī)定的供人類接觸的參考劑量20 μg·kg-1,而嬰幼兒和青少年大量食用肉類和奶制品而暴露的DEHP 每日可達90.6 μg·kg-1和21.6 μg·kg-1,也超過了這一閾值[8]。 此外,研究發(fā)現(xiàn)從醫(yī)療器械中遷移出的DEHP 對暴露患者具有潛在的生殖毒性影響,尤其是在敏感的亞群,如孕婦及嬰幼兒等[9-10]。 重癥監(jiān)護中的新生兒每日DEHP 暴露量可達16 mg·kg-1,遠高于估計的安全限值,可能通過多種機制促進炎癥發(fā)展,導致大多數(shù)新生兒以炎癥介導為主要特征的組織損傷[11]。

研究發(fā)現(xiàn),DEHP 暴露可對人體內分泌[12]、生殖[13]、肝臟[14]、心臟[15]和神經(jīng)[16]等產(chǎn)生毒性作用,但目前在神經(jīng)方面的研究主要集中于孕婦產(chǎn)前DEHP接觸對胎兒生長發(fā)育[17-18]以及兒童注意力表現(xiàn)的影響[19],但其具體機制尚不清楚,并且對成年人體健康風險的評估也相對較少。

新證據(jù)表明,鄰苯二甲酸酯類暴露會加劇神經(jīng)退行性疾病的患病風險[20]。 多項研究表明,DEHP暴露可以引起實驗動物神經(jīng)行為改變[21-23],但目前尚無對人類神經(jīng)行為影響的研究報道。 DEHP 暴露可以導致大小鼠學習和記憶障礙[24-25]。 病例對照研究表明,產(chǎn)前和產(chǎn)后DEHP 暴露與注意缺陷多動障礙之間存在關聯(lián)[26]。 最新研究發(fā)現(xiàn)DEHP 增加了自閉癥兒童單核細胞的炎癥轉錄因子以及炎性細胞因子的分子表達水平,揭示了其可能對自閉癥相關的免疫功能障礙存在潛在影響[27]。 鑒于DEHP 在環(huán)境中普遍存在的潛在重大公共衛(wèi)生影響,識別DEHP 的神經(jīng)毒性作用及其相關機制,可為揭示DEHP 誘導的神經(jīng)退行性疾病的可能機制提供重要的理論依據(jù)。

1 DEHP 進入腦的途徑(How DEHP enters the brain)

已確定人類大腦有DEHP 暴露的風險,DEHP對大腦的影響,可能涉及以下途徑(圖1)。(1)胎盤屏障。 嚙齒動物模型研究表明,DEHP 可以穿過大鼠的胎盤屏障進入胎鼠血液循環(huán)[28],破壞胎盤的正常發(fā)育,從而影響神經(jīng)發(fā)育并導致畸胎。 妊娠期和產(chǎn)后DEHP 暴露可對大鼠大腦發(fā)育和功能產(chǎn)生有害影響[29]。(2)血腦屏障。 DEHP 易通過血腦屏障,并影響大腦發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)功能,醫(yī)院來源的人體母體血漿樣本中檢出DEHP 水平為(1.15±0.81)μg·mL-1,新生兒臍帶血漿中 DEHP 水平為(2.05±1.47) μg·mL-1,國內外的隊列研究均表明孕婦產(chǎn)前DEHP 暴露與兒童不良的認知和行為結果相關[30-31]。(3)腸-腦途徑。 在發(fā)育窗口期暴露于環(huán)境中的化學物質是神經(jīng)發(fā)育障礙的成因[32-33],而這些障礙與微生物群失調相關。 研究表明,DEHP 可以直接改變腸道菌群,從而增加與行為異常有關的潛在神經(jīng)毒性微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[34]。

圖1 DEHP 進入腦的途徑注:DEHP 表示鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯。Fig.1 The way that DEHP enters the brainNote: DEHP stands for di-(2-ethylhexyl) phthalate.

2 DEHP 對機體神經(jīng)毒性的表現(xiàn)(The neurotoxicity of DEHP)

2.1 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷(Damages to the central nervous system)

在胚胎期和幼兒期,由于血腦屏障尚未完全成熟,因此,DEHP 很容易通過血腦屏障進入到腦組織,進而產(chǎn)生毒性作用。 研究表明,暴露于 DEHP會損害胎盤的發(fā)育和功能[35],例如,母體DEHP 暴露后胎盤質量降低,胎盤迷宮層的血竇面積減少[36],會對胎兒的成長產(chǎn)生不利影響。 50 mg·kg-1和200 mg·kg-1DEHP 暴露可能會通過胎盤運輸干擾甲狀腺激素的水平,影響小鼠發(fā)育中的大腦神經(jīng)細胞的增殖和遷移[37],還可以通過干擾胎盤甲狀腺激素受體信號傳導導致胎兒子宮內生長受限[38]。

DEHP 進入腦組織后不僅會損害神經(jīng)元的結構,還會影響其功能。 例如,出生前 DEHP 暴露會影響大鼠大腦性分化區(qū)域的神經(jīng)元,并隨后導致神經(jīng)變性[39]。 此外,出生后暴露會引起小鼠運動亢進和多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的大大減少[40]。

DEHP 還會對腦組織的不同部位產(chǎn)生不同程度的損傷。 如產(chǎn)前暴露會損害小鼠新皮層的發(fā)育[41]。出生后16 d 到22 d 的雄性和雌性Long Evans 大鼠急性DEHP 暴露可以減少雄性大鼠海馬CA3 區(qū)遠端角質層中的軸突標記,降低齒狀回和CA3 中未成熟和成熟神經(jīng)元的細胞密度[42]。 母體DEHP 暴露后出生7、14 和21 d 的雄性幼鼠的海馬CA1 亞區(qū)中基底樹突的總長度和分支數(shù)減少[43]。 研究還發(fā)現(xiàn),0.1 mol·L-1和 0.3 mol·L-1的 DEHP 暴露還可抑制CA1 錐體細胞的電壓門控鉀通道,進而抑制神經(jīng)元的興奮性和突觸可塑性,從而損害了實驗動物的空間學習和記憶能力[25]。

越來越多的研究表明DEHP 暴露與神經(jīng)元破壞之間存在關聯(lián)。 DEHP 不僅會破壞神經(jīng)細胞的完整性,使其活力下降,還會激活凋亡信號通路使神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡、抑制細胞增殖等。 研究表明,DEHP具有細胞毒性,并可誘導神經(jīng)瘤母細胞(mouse neuroblastoma N2a cells, Neuro-2a)凋亡[44]。 10 μmol·L-1DEHP 處理小鼠神經(jīng)元和原代神經(jīng)膠質細胞24 h 后,鈣黃綠素AM 染色顯示活神經(jīng)元數(shù)目減少且神經(jīng)膠質細胞數(shù)量增加[45],表明神經(jīng)元-膠質細胞培養(yǎng)物由于暴露于DEHP 而受到損傷,為了維持神經(jīng)元環(huán)境穩(wěn)態(tài)并保護神經(jīng)元免受有毒化學物質影響,膠質細胞增生機制被啟動[46]。

2.2 對神經(jīng)行為的損害(Damage to neurobehavior)

DEHP 作為一種環(huán)境內分泌干擾物,具有擬雌激素活性,早期暴露可能會破壞甲狀腺功能,從而對兒童的神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生不利影響[47]。 隊列研究表明,孕期DEHP 暴露與兒童認知和神經(jīng)行為改變有關,后代普遍表現(xiàn)出較低的認知得分,較差的內在(情緒、同伴關系等)和外在(多動/沖動等)行為;同時該研究還指出DEHP 暴露對認知、心理活動和行為發(fā)展的影響存在性別差異,DEHP 對男性后代神經(jīng)行為的影響更為顯著[48]。 另一項為期15年的隨訪出生隊列研究結果表明,產(chǎn)前和兒童時期DEHP 暴露可能會影響8 ~14 歲兒童行為綜合征的發(fā)展[49]。DEHP 影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育可能與甲狀腺激素的功能有關,而甲狀腺激素在大腦發(fā)育和成熟的許多基本過程中起著必不可少的作用;DEHP 還可能通過干擾脂質信號傳導途徑改變大腦中脂質分布,進而影響大腦發(fā)育[46,50]。 此外,DEHP 的抗雄激素特性可能會影響性腺激素介導的神經(jīng)發(fā)育過程,從而導致暴露結果的性別差異[51]。

3 神經(jīng)毒性機制(Neurotoxicity mechanism)

3.1 細胞凋亡(Apoptosis)

DEHP 對神經(jīng)毒性的研究目前主要集中在誘導神經(jīng)細胞凋亡方面。 細胞凋亡是一種受基因調控的程序性死亡過程。 DEHP 以劑量依賴的方式顯著抑制細胞活力從而引起神經(jīng)細胞凋亡,還可引起神經(jīng)細胞半胱天冬酶3(Caspase-3)蛋白表達水平顯著增加。 Caspase-3 蛋白作為Caspase 家族的主要效應分子,在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用,提示凋亡進入不可逆的階段[52](圖2)。 例如,在經(jīng)DEHP 處理的小鼠海馬神經(jīng)元細胞系(hippocampal neuronal cell line,HT22)細胞中,與處理前對比,DEHP 以劑量依賴的方式顯著上調細胞中的Caspase-8、Caspase-3 和促凋亡基因Bax 的蛋白含量水平,同時顯著下調抗凋亡蛋白Bcl-2 的蛋白水平,這表明DEHP 可以誘導小鼠HT22 細胞凋亡[53]。 此外,長期暴露于0.1 ~100 μmol·L-1DEHP,可以激活神經(jīng)母細胞瘤細胞(SHSY5Y)中的Caspase-3,導致劑量依賴性細胞凋亡[54]。 經(jīng)DEHP 處理的嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)出現(xiàn)p53 和Caspase-3 依賴性凋亡,同時Bax 蛋白表達增加且 Bcl-2 蛋白表達降低[55]。 除此之外,暴露于DEHP 還會誘導小鼠神經(jīng)細胞瘤細胞系(N2a)細胞凋亡,并下調腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)、突觸后致密蛋白 95(postsynaptic density protein 95, PSD95)和突觸蛋白-1(synaptophysin 1, SYN1)的表達;降低環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cyclic adenosine phosphate response element binding protein, CREB)信號通路中蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)的磷酸化水平,Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ, CaMKⅣ)、蛋白激酶 A(protein kinase A, PKA)和CREB 的催化亞基的表達水平[56]。

3.2 氧化損傷(Oxidative damage)

研究認為DEHP 可以通過激活生物體內的過氧化物酶體增生物激活受體(PPAR),引起編碼過氧化氫酶的基因的選擇性轉錄,使以活性氧為主的各種自由基含量增加,導致氧化應激狀態(tài)[57-58],一旦活性氧清除系統(tǒng)的動態(tài)平衡遭到破壞后,就會造成嚴重的氧化損傷[59]。 DEHP 可以增加丙二醛的含量,降低谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性以及谷胱甘肽的含量。 研究發(fā)現(xiàn),DEHP 以劑量依賴的方式顯著抑制小鼠HT22 細胞活力并增加乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase, LDH)從細胞中的釋放;而活性氧抑制劑乙酰半胱氨酸可以拮抗DEHP的作用[53]。 此外,DEHP 誘導的氧化應激還可以通過小鼠海馬HT22 細胞中的線粒體裂變觸發(fā)神經(jīng)元細胞死亡。 過氧化物酶5(peroxiredoxin 5,Prx5)是一種抗氧化酶,可以作為H2O2的傳感器和收發(fā)器并通過細胞內氧化信號通路參與細胞信號傳導[60],在此能通過抑制活性氧的產(chǎn)生來阻止DEHP 誘導的線粒體裂變;提示DEHP 暴露可能通過抑制Prx5 的活性進而影響活性氧的活性從而引起氧化損傷[61-62]。暴露于1 000 mg·kg-1的DEHP 還可通過調節(jié)線粒體動力學和生物發(fā)生激活轉錄因子NF-E2 相關因子2(Nrf2)介導的抗氧化防御反應,觸發(fā)鵪鶉的腦線粒體功能障礙和氧化應激[63](圖2)。 綜上所述,DEHP 誘發(fā)氧化應激的主要機制可能與其影響線粒體的分裂和融合、干擾抗氧化酶基因的表達以及抑制抗氧化酶的活性有關(圖3)。

圖2 DEHP 作用的潛在機制圖注:P 表示磷酸化;DEHP 表示鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯;BDNF 表示腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;PSD95 表示突觸后致密蛋白95;SYN1 表示突觸蛋白-1;Akt 表示蛋白激酶B;PKA 表示蛋白激酶A;CREB 表示環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白;Caspase-3 表示半胱天冬酶3;Caspase-8 表示半胱天冬酶8;CaMKⅣ表示Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ;Bax 表示促凋亡蛋白;Bcl-2 表示抗凋亡蛋白;Nrf2 表示轉錄因子NF-E2 相關因子2。Fig.2 Diagram of the underlying mechanism of DEHP’s actionNote: P stands for phosphorylation; DEHP stands for di-(2-ethylhexyl) phthalate;BDNF stands for brain-derived neurotrophic factor; PSD95 stands for postsynaptic density protein 95; SYN1 stands for synapsin-1; Akt stands for protein kinase B; PKA stands for protein kinase A; CREB stands for cyclic adenosine phosphate response element binding protein; Caspase-3 stands for cysteinyl aspartate specific proteinase 3; Caspase-8 stands for cysteinyl aspartate specific proteinase 8; CaMKⅣstands for Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅳ; Bax stands for pro-apoptotic gene; Bcl-2 stands for anti-apoptotic protein; Nrf2 stands for transcription factor NF-E2 related factor 2.

圖3 DEHP 的神經(jīng)毒性機制Fig.3 The neurotoxic mechanism of DEHP

3.3 表觀遺傳調控的改變(Changes in epigenetic regulation)

研究表明,鄰苯二甲酸酯可通過表觀遺傳學調控改變胎盤基因的表達,從而影響其正常活動[64]。 表觀遺傳調控機制主要包括DNA 甲基化、非編碼RNA(包括 microRNA、lncRNA)的表達/活性失調等[65]。 在子宮內新生兒DEHP 暴露可能會導致基因啟動子區(qū)域附近CpG 島處的DNA 超甲基化/次甲基化、組蛋白修飾以及非編碼RNA 的表達。 這些表觀遺傳標記可以誘導基因表達的變化,而這些變化可能持續(xù)一生,并可能導致不良的結局[66]。 microRNA 已證明在海馬神經(jīng)元的發(fā)育中起重要作用,例如miRNA 可以響應信號,調節(jié)海馬神經(jīng)元的形態(tài)和可塑性,還可調節(jié)神經(jīng)突觸的形成和成熟等[67]。 DEHP 暴露會損害雄性大鼠海馬突觸前和突觸后元素的正常發(fā)育,但對雌性大鼠海馬卻沒有影響。 結果表明,DEHP 暴露具有以性別特異性方式調節(jié)microRNA 的潛力,這可能會干擾雄性海馬的正常發(fā)育[68]。 此外,因參與斑馬魚大腦發(fā)育過程而聞名的保守lncRNA Cyrano[69],用濃度為2 ng·L-1DEHP 處理斑馬魚胚胎就能引起其表達發(fā)生變化,且當DEHP 達到一定濃度時就能引起神經(jīng)發(fā)育相關基因的表達改變,這說明cyrano 參與了DEHP 引起的斑馬魚神經(jīng)毒性效應。

3.4 鈣穩(wěn)態(tài)失調(Calcium homeostasis disorder)

神經(jīng)元細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)失調在許多神經(jīng)毒性作用中發(fā)揮了關鍵作用,包括損害大腦發(fā)育和行為功能障礙[70-71]。 DEHP 可以誘導微粒體囊泡中Ca2+的釋放,可能與Ryanodine 受體介導的作用機制相關[36]。 有研究發(fā)現(xiàn),DEHP 暴露可導致離體培養(yǎng)的大鼠腦垂體神經(jīng)末梢和嗜鉻細胞瘤細胞內的Ca2+水平升高[72]。 離子通道研究表明 100 μmol·L-1和300 μmol·L-1的 DEHP 可抑制鈣通道的峰值電流幅度,且可通過抑制鈣通道活性調節(jié)果蠅觸角中投射神經(jīng)元的膽堿能小突觸傳遞[73]。 鈣調蛋白(CaM)是鈣調蛋白家族中分布最廣泛且功能最全的蛋白質之一。 當Ca2+快速升高時,Ca2+/CaM 依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可以被激活。 暴露于DEHP 后,青春期2 型糖尿病小鼠相較于青春期正常小鼠的CaM 和CaMKⅡ磷酸化水平顯著增加,表明DEHP 可能導致Ca2+濃度升高,Ca2+與CaM 結合,進而導致下游CaMKⅡ磷酸化水平升高,這可能是DEHP 潛在的神經(jīng)毒性機制之一[74]。 基于此,表明鈣穩(wěn)態(tài)失調在DEHP 介導的神經(jīng)毒性中的潛在作用,可為進一步研究奠定基礎。

3.5 對神經(jīng)遞質的影響(Effects on neurotransmitters)

神經(jīng)遞質在腦功能活動中起著重要的作用,DEHP 暴露可對腦內的遞質產(chǎn)生影響。 5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT),又稱血清素,被認為是一種抑制性神經(jīng)遞質,可從位于腦干中縫核中的神經(jīng)元中釋放出來,并調節(jié)認知和情緒等[75]。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)中,γ-氨基丁酸(GABAergic, GABA)是主要的抑制性神經(jīng)遞質[76]。青春期雄性 ICR 小鼠經(jīng)口 DEHP(0.18、1.8、18 和180 mg·kg-1·d-1)暴露 3 周,酶聯(lián)免疫吸附試驗和 Western blot 結果顯示DEHP 顯著降低了5-HT 和GABA的含量,表明DEHP 可以顯著減少神經(jīng)遞質的釋放[74]。 此外,自妊娠開始直至斷奶,雌性大鼠口服暴露于劑量為30 mg·kg-1d-1的DEHP,其青春期雄性大鼠后代中,腦內興奮性氨基酸天門冬氨酸的含量顯著下降,而具有抑制特性的GABA 的含量則顯著增加[77],此變化可能涉及生殖軸的神經(jīng)內分泌調節(jié)從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。 青春期前DEHP 暴露可導致多巴胺能系統(tǒng)的異常發(fā)育,從而影響青春期后大鼠的神經(jīng)行為功能[78]。 慢性DEHP 產(chǎn)后暴露可引起年輕成年雄性大鼠睪丸軸神經(jīng)內分泌調節(jié)的破壞,并且這種作用與焦慮樣行為相關,由于GABA激動劑可以逆轉這些作用,因此提示GABA 可能參與DEHP 誘導的生殖影響和行為改變[79]。

4 與神經(jīng)退行性疾病的關系(Relationship with neurodegenerative diseases)

越來越多的研究表明環(huán)境因素可能是導致神經(jīng)退行性疾病的主要原因之一[80-82]。 鑒于老年人中胰島素抵抗與阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)發(fā)病機理之間的潛在關系,有研究調查了圍產(chǎn)期DEHP 暴露與阿爾茨海默癥發(fā)病機理之間的關系。 結果表明,圍產(chǎn)期暴露于DEHP 可能會影響海馬中胰島素的表達和胰島素-Akt-糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β)信號通路[83]。 此外,在暴露于DEHP 的大鼠后代中還觀察到認知能力受損和Tau 磷酸化水平升高[83],由此表明圍產(chǎn)期暴露于DEHP 可能是與海馬胰島素抵抗和胰島素代謝紊亂相關的阿爾茨海默癥發(fā)病機制的潛在危險因素。 也有研究表明早期和長期暴露于DEHP 會增加秀麗隱桿線蟲阿爾茨海默癥模型的Aβ毒性[84]。

進入腸道內的DEHP 會改變腸道微生物群落的多樣性[85]、結構組成和代謝產(chǎn)物譜[34],隨后可能改變其免疫反應等[86],最終進入血液循環(huán)干預大腦的功能。 最近的研究表明腸道菌群與神經(jīng)退行性疾病有關。 目前,盡管沒有直接證據(jù)表明DEHP 暴露與腸道菌群介導的神經(jīng)退行性疾病相關。 但有研究表明腸道和大腦形成“微生物群-腸-腦軸”關聯(lián)[87-88],腸道菌群參與腸道和大腦之間的雙向通訊,表明腸道菌群的調節(jié)對神經(jīng)元途徑誘導有著有益作用,從而延遲阿爾茨海默癥進展[89]。 因此,DEHP 暴露引起的腸道菌群改變可能通過腸-腦軸參與阿爾茨海默癥的進展。

5 結語(Conclusion)

DEHP 已成為環(huán)境中普遍存在的污染物,越來越多的研究表明DEHP 暴露對人體和動物存在潛在的危害,不得不引起我們的重視。 目前,有關神經(jīng)毒性機制的研究還有待完善,DEHP 與神經(jīng)退行性疾病之間的關系仍缺乏相關理論與實驗依據(jù)。 因此,加強DEHP 暴露的人群流行病學調查,繼續(xù)深入研究DEHP 暴露的毒性效應及分子機制,以及與神經(jīng)退行性疾病之間的聯(lián)系和作用機制,可為疾病防治提供新的機遇,也將為今后制定更為合理的、針對不同暴露人群的安全限值和暴露限值提供理論參考。