斑節(jié)對蝦PP2C基因的克隆及其在急性低鹽和氨氮脅迫下表達模式的相關(guān)研究

司夢茹，李運東，楊其彬，姜 松，楊麗詩，黃建華，江世貴，周發(fā)林

1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院 201306

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018

PP2C蛋白磷酸酶，又稱金屬依賴性蛋白磷酸酶 (Metal-dependent protein phosphatases, PPMs)，可以對磷酸化的絲/蘇氨酸殘基特異性脫磷酸[1]。目前已鑒定出PP2Cα，PP2Cβ，PP2Cγ，PP2CCδ/Wip1等16個PP2C基因[2-3]。不同的PP2C亞型在細胞應(yīng)激、細胞周期、細胞凋亡、新陳代謝、RNA剪接及線粒體功能等調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。迄今為止，已在古細菌、細菌、真菌、動物、植物等多種生物中發(fā)現(xiàn)PP2C家族的存在[7-11]。研究表明，PP2C主要通過ABA和MAPK信號通路或某些離子通道參與生物的抗逆境脅迫反應(yīng)[12]。MAPK通路可以通過MKKK、MKK和MAPK 3種激酶的依次激活調(diào)節(jié)生物對環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)[13]。在生理性和外界應(yīng)激條件下，PP2Cα通過對MAPK亞家族JNK上游調(diào)節(jié)因子MKK4和MKK7脫磷酸參與調(diào)節(jié)應(yīng)激活化的MAPK信號通路，負調(diào)節(jié)MAPK信號通路從細胞膜到細胞核或其他的亞細胞靶點的刺激傳遞[9,14]。其中，PP2C是參與MAPK磷酸化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因，尤其在外界應(yīng)激過程中，機體通過調(diào)節(jié)PP2C的表達來維持正常生命活動，在環(huán)境適應(yīng)及外源免疫過程中發(fā)揮重要作用[9]。例如，Bollmann 等[15]發(fā)現(xiàn)，PP2C在小鼠 (Mus musculus)心肌細胞中表達，在油酸應(yīng)激過程中誘導(dǎo)細胞凋亡。但有關(guān)PP2C在甲殼動物中的研究十分缺乏，尚未見PP2C在斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon) 中急性應(yīng)激應(yīng)答的相關(guān)報道。

多數(shù)水生甲殼動物對急性低鹽和氨氮變化比較敏感[16]。有研究報道，急性鹽度變化影響斑節(jié)對蝦的免疫和代謝反應(yīng)，會增強其對病原菌的易感性[17]。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，氨對多種對蝦有強烈的負面影響，氨氮升高會降低其生長速度，增加蛻皮頻率并損害器官 (肝胰腺和鰓) 等[18]。有關(guān)低鹽和氨氮應(yīng)激相關(guān)基因的研究已經(jīng)在多種甲殼動物中展開，但目前對斑節(jié)對蝦急性低鹽和氨氮應(yīng)答的研究尚不夠深入，對滲透調(diào)節(jié)和氨氮解毒代謝途徑中起到調(diào)控作用的關(guān)鍵酶及其基因的研究仍有不足[19]。因此，本研究通過RACE技術(shù)克隆得到了斑節(jié)對蝦PP2C基因 (PmPP2C) cDNA全長，分析了PP2C在斑節(jié)對蝦各個組織中的表達情況，并對其在96 h急性低鹽脅迫和氨氮脅迫過程中的表達變化規(guī)律進行了分析，以期為深入探究斑節(jié)對蝦PP2C基因的抗逆機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用斑節(jié)對蝦取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地。實驗前選取體長為(12.37±0.57) cm、質(zhì)量為 (15.08±1.20) g 的對蝦，暫養(yǎng)于 4.7 m×4.1 m×1.7 m 的自然海水 (鹽度 30) 水泥池中3 d，養(yǎng)殖水體積4.8 m3，水體充分曝氣，溫度25～28 ℃。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機選取健康完整的雌、雄對蝦數(shù)尾，分別取其表皮、肝胰腺、鰓、胃、心臟、肌肉、眼柄神經(jīng)、腦神經(jīng)、胸神經(jīng)、卵巢、精巢等組織樣品，置于 RNAlater Solution (Ambion，上海) 4 ℃ 過夜后于?80 ℃ 冰箱中保存。

1.2 總 RNA 的提取及 cDNA 的制備

按照 HiPure Universal RNA Mini Kit (Magen，廣州) 試劑盒說明書提取上述樣品的總RNA。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，NanoDrop 2000 (Thermo Fisher，美國) 檢測其濃度和純度后備用。進行熒光定量的樣品按照PrimeScriptTM Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa，上海) 試劑盒說明書進行cDNA合成，產(chǎn)物經(jīng)EF-1α檢測后于?80 ℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PmPP2C 的 cDNA 克隆

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得PmPP2C基因的EST序列，利用Primer Premier 5設(shè)計特異性引物PmPP2CF1/R1、PmPP2C-F2/R2 (表1) 以驗證序列的正確性。按照 SMARTer RACE 5'/3' Kit User Manual(TaKaRa，上海) 試劑盒說明書制作cDNA末端快速擴增模板，擴增PmPP2CcDNA的5'和3'末端。

表1 實驗中所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in experiment

1.4 PmPP2C 的生物信息學(xué)分析

通過克隆獲得PmPP2CcDNA全長。利用軟件DNAMAN對測序序列進行拼接。利用NCBI中的 ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)工具預(yù)測開放閱讀框。利用EMBOSS(https://www.bioinformatics.nl/emboss-explorer/) 翻譯其氨基酸序列。利用NCBI中的BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) 工具對預(yù)測的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行相似性比對。利用軟件Clustal X 進行多重序列比對。利用 ExPASy Prot-Param (https://web.expasy.org/protparam/) 預(yù)測各種氨基酸含量、理論等電點及理論分子質(zhì)量。利用SMART 4.0 (http://smart.embl-heidelberg.de/) 分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。利用 NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 預(yù)測糖基化位點。利用 NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 預(yù)測磷酸化位點。利用SOPAM (https://npsa-prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。利用SWISS MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) 預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。利用軟件Clustal X和MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 96 h 急性低鹽脅迫實驗

通過預(yù)實驗確定斑節(jié)對蝦96 h急性鹽度脅迫的半致死濃度 (LC50) 以及安全濃度 (SC)。預(yù)實驗期間不投喂飼料，每隔2 h記錄死亡情況并撈取死蝦至96 h實驗結(jié)束。實驗結(jié)束以鹽濃度為x軸，死亡率為y軸，建立直線回歸方程：y=a+bx，直線內(nèi)插法計算出LC50和SC分別為鹽度3和17。

正式實驗分為3組，分別為對照組 (鹽度30)、中濃度脅迫組 (SC=鹽度17)、低濃度脅迫組(LC50=鹽度3)。每組設(shè)置3個桶，每桶放置30尾蝦。用正常海水調(diào)節(jié)各桶水體鹽度到實驗鹽度。養(yǎng)殖溫度為25～28 ℃，pH為7.0～7.5。實驗期間每隔3 h撈取死蝦并做好記錄，每隔24 h更換全部海水以保證水質(zhì)和鹽度基本不變。分別于脅迫后的第0、第3、第6、第12、第24、第48、第72和第96小時取樣。每個時間點選取3尾活力較好的蝦，取其肝胰腺和鰓組織樣品置于RNAlater Solution (Ambion，上海) 4 ℃ 過夜后于?80 ℃ 冰箱中保存。

1.6 96 h 急性氨氮脅迫實驗

通過預(yù)實驗確定斑節(jié)對蝦96 h急性氨氮脅迫的LC50以及SC。預(yù)實驗期間不投喂飼料，每隔2 h記錄死亡情況并撈取死蝦至96 h實驗結(jié)束。實驗結(jié)束以氨氮濃度為x軸，死亡率為y軸，建立直線回歸方程：y=a+bx，直線內(nèi)插法計算出LC50和SC 分別為 29.47 和 2.95 mg·L?1。

正式實驗分為3組，分別為對照組 (正常海水)、低氨氮脅迫組 (SC=2.95 mg·L?1)、高氨氮脅迫組 (LC50=29.47 mg·L?1)。每組設(shè)置 3 個桶，每桶放置30尾蝦。水體氨氮濃度通過添加氯化銨(NH4Cl) 調(diào)節(jié)。養(yǎng)殖溫度為 25～28 ℃，pH為7.0～7.5。實驗期間每隔3 h撈取死蝦并做好記錄，每隔24 h更換全部海水以保證水質(zhì)和氨氮濃度基本不變。分別于脅迫后的第0、第3、第6、第12、第24、第48、第72和第96小時取樣。每個時間點選取3尾活力較好的蝦，取其肝胰腺和鰓組織樣品置于 RNAlater Solution (Ambion，上海) 4 ℃過夜后于?80 ℃冰箱中保存。

1.7 實時熒光定量 PCR

用于PmPP2C基因表達分析的熒光定量引物PmPP2C-qF/qR 利用 Primer Premier 5 設(shè)計 (表1)。內(nèi)參基因使用EF-1α-qF/qR (Elongation factor 1α)，以斑節(jié)對蝦各組織以及96 h鹽度脅迫和氨氮脅迫組織 cDNA 為模板，使用 Roche LightCycler?480Ⅱ(Roche) 對斑節(jié)對蝦PP2C進行RT-PCR擴增。RTPCR 的反應(yīng)體系為 12.5 μL，包括 SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (瑞真，廣州) 6.25 μL，PmPP2C-qF 和PmPP2C-qR 各 0.5 μL， cDNA 模板(約 60 ng·μL?1) 1 μL，ddH2O 4.25 μL。每個樣品設(shè)置3個平行和內(nèi)參對照，同時設(shè)置陰性和陽性對照。RT-PCR 程序設(shè)置為 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min；50 ℃ 30 s。定量結(jié)果分析使用相對CT法 (2?△△Ct)，利用統(tǒng)計分析軟件IBM SPSS 20.0對實驗結(jié)果進行單因素方差 (One Way ANOVA) 分析，并進行 Turkey's 檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 PmPP2C 序列分析

通過克隆獲得了PmPP2CcDNA全長，共2 151 bp，GenBank 登錄號為 MZ802856，包括 5'非編碼區(qū) (UTR) 31 bp，3' UTR 41 bp，包括 26 個堿基的 poly (A) 尾，開放閱讀框 (ORF) 2 079 bp，可編碼 692 個氨基酸 (圖1)。ExPASy ProtParam 計算分析表明，PmPP2C的相對分子量為74.83 kD，理論等電點 (pI) 為5.48，其中包括89個強酸性氨基酸 (Asp+Glu) 和 70 個強堿性氨基酸 (Arg+Lys)。預(yù)測其不穩(wěn)定指數(shù) (Ⅱ)、脂肪指數(shù)和親水性平均值(GRAVY) 分別為 46.88、77.01 和?0.54。磷酸化位點預(yù)測其上具有34個絲氨酸 (S) 位點，16個蘇氨酸 (T) 位點和 2 個酪氨酸 (Y) 位點。糖基化位點預(yù)測其上具有6個主要的糖基化位點。

圖1 PmPP2C 核酸序列及氨基酸序列展示Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of PmPP2C

2.2 PmPP2C 氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用Blast對PmPP2C氨基酸序列和其他物種的PP2C氨基酸序列進行同源性比對，結(jié)果顯示PmPP2C 與凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 的同源性較高，相似度高達96.77%，而與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 的相似度為 63.6% (圖2)。NCBI下載16個不同物種的PP2C序列，利用Clustal X和MEGA 6.0軟件比對斑節(jié)對蝦與其他物種PP2C的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 (圖3)。結(jié)果顯示斑節(jié)對蝦與凡納濱對蝦 (ROT72201.1) 親緣關(guān)系最近并聚為一支。

圖2 PmPP2C c亞型與其他物種氨基酸序列比對Fig. 2 Multiple alignment of PmPP2C c subtype amino acid sequences from P. monodon and other species

圖3 運用Clustal和MEGA 6.06軟件基于NJ法構(gòu)建PmPP2C c亞型與其他物種的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 NJ phylogenetic tree of PmPP2C c subtype with other species by Clustal and MEGA 6.06

2.3 PmPP2C 的結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA軟件對PmPP2C的氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示其有203個α-螺旋，約占29.34%；38個β-轉(zhuǎn)角，約占5.49%；359個無規(guī)則卷曲，約占51.88%；92個延伸鏈，約占13.29% (圖4)。CD-search在線預(yù)測表明PmPP2C具有PP2C c型結(jié)構(gòu)域，位于167—351個氨基酸之間。三維結(jié)構(gòu)分析表明，PmPP2C具有鈣離子(Ca2+) 結(jié)合位點，但不具有保守性 (圖5)。

圖4 SOPMA軟件對PmPP2C蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig. 4 Secondary structure of PmPP2C protein predicted by SOPMA

圖5 斑節(jié)對蝦PP2C三維結(jié)構(gòu)空間示意圖Fig. 5 Three-dimensional ribbon structure of PmPP2C

2.4 PmPP2C 在不同組織中的表達

利用實時定量PCR技術(shù)檢測PmPP2C基因在斑節(jié)對蝦11種組織中的轉(zhuǎn)錄表達水平 (圖6)。結(jié)果顯示，PmPP2C在斑節(jié)對蝦各個組織均有表達，在肝組織中表達量最高，其次是鰓、胸神經(jīng)、精巢、肌肉、心臟，在表皮、腦神經(jīng)、眼柄神經(jīng)、胃、腸道、卵巢等組織中表達量很低。

圖6 PmPP2C在各組織的相對表達量Fig. 6 Expression of PmPP2C in different tissues

2.5 PmPP2C 在低鹽脅迫下的表達

96 h急性低鹽脅迫檢測結(jié)果顯示，在肝胰腺中(圖7-a)，中濃度組和低濃度組與對照組相比，除脅迫后第3小時外，整體變化趨勢為先下調(diào)再上調(diào)，最后趨于平穩(wěn)。其中低濃度組較中濃度組變化趨勢比較不平穩(wěn)，在脅迫后第3小時出現(xiàn)了顯著上調(diào)，為對照組的4.46倍。在鰓中 (圖7-b)，中濃度組和低濃度組與對照組相比，除脅迫后第12和第24小時，其他時間點都有不同程度下調(diào)。

圖7 急性低鹽脅迫下斑節(jié)對蝦PmPP2C在肝胰腺和鰓組織中的相對表達水平Fig. 7 mRNA relative expression of PmPP2C in hepatopancreas and gill under acute low salt stress

2.6 PmPP2C 在氨氮脅迫下的表達

96 h急性氨氮脅迫檢測結(jié)果顯示，在肝胰腺中(圖8-a)，高濃度組和低濃度組較對照組表達水平顯著上調(diào)，均在第12小時達到上調(diào)高峰點，分別為對照組的3.22和6.32倍。鰓組織中 (圖8-b)，低濃度組較對照組表達水平顯著上調(diào)，其中第3、第12、第24、第48、第72小時是上調(diào)的高峰點，表達量分別約為對照組的2.56、3.32、2.13、3.15、2.59倍。高濃度組較對照組表達水平整體呈現(xiàn)下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)趨勢，并在第24小時表達水平最高，約為對照組的2.75倍，第96小時為對照組的0.88倍。

圖8 急性氨氮脅迫下斑節(jié)對蝦PmPP2C在肝胰腺和鰓組織中的相對表達水平Fig. 8 mRNA relative expression of PmPP2C in hepatopancreas and gill under acute ammonia nitrogen stress

3 討論

3.1 PmPP2C 序列分析

有研究表明，細胞內(nèi)DNA損傷可通過蛋白的磷酸化進行調(diào)節(jié)[20-22]。細胞內(nèi)約30%的蛋白都被磷酸化，其中有超過98%的修飾都發(fā)生在絲氨酸/蘇氨酸位點上[23]。本文從本項目組斑節(jié)對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中PP2C部分序列，設(shè)計RACE引物，成功從斑節(jié)對蝦體內(nèi)克隆了PP2C基因全長cDNA序列。通過成熟肽的同源性比較發(fā)現(xiàn)，該基因與凡納濱對蝦PP2C-like同源性最高，由此可確定擴增的基因為斑節(jié)對蝦的PP2C基因。結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，PmPP2C成熟肽氨基酸序列包含一個典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶c型結(jié)構(gòu)域，具多個絲氨酸、蘇氨酸蛋白酶磷酸化位點，可能對許多反應(yīng)起著生物“開/關(guān)”作用[13]。NetNGlyc糖基化位點預(yù)測可能存在5個糖基化位點，可能在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子識別和免疫應(yīng)激等過程中發(fā)揮作用[24]。經(jīng)多重比對發(fā)現(xiàn)，PmPP2C與凡納濱對蝦的PP2C氨基酸序列同源性較高，說明PP2C在這兩種物種中較為保守。

3.2 PmPP2C 的組織表達

PP2C基因在斑節(jié)對蝦中的組織分布研究發(fā)現(xiàn)其在所有檢測組織中均有表達，但組織間表達量差異較大。PmPP2C基因在對蝦肝胰腺和鰓中表達量最高，其次為胸神經(jīng)和精巢，在其他組織中表達量較低。PmPP2C的這種組織特異性表明肝胰腺和鰓可能是其發(fā)揮作用的重要組織。Davie等[25]研究發(fā)現(xiàn)，PP2C在哺乳動物肝細胞氨氮應(yīng)激調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究中PP2C在斑節(jié)對蝦肝胰腺中高表達，肝胰腺是水生甲殼動物的主要氨氮解毒代謝和排泄器官，推測其可能參與斑節(jié)對蝦氨氮解毒代謝或排泄調(diào)節(jié)過程[26]。此外，已有研究報道PP2C在植物根系、葉片等滲透調(diào)節(jié)器官中具有重要作用。例如Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)玉米根中分離的ZmPP2C在調(diào)節(jié)擬南芥 (Arabidopsis thaliana) 對鹽和干旱的耐受性中具有重要作用。植物葉片PP2C還可通過負調(diào)節(jié)ABA信號通路增強植物對干旱和高鹽等脅迫的適應(yīng)性[28]。本研究中PmPP2C在鰓中高表達，鰓作為甲殼動物主要的滲透調(diào)節(jié)器官，推測PmPP2C可能在斑節(jié)對蝦的滲透調(diào)節(jié)中具有重要作用[29]。

3.3 PmPP2C 的 96 h 急性應(yīng)激應(yīng)答

水產(chǎn)養(yǎng)殖用水水質(zhì)很容易受到外部因素的影響，進而影響?zhàn)B殖對象的細胞凋亡和免疫應(yīng)答應(yīng)激機制，導(dǎo)致生長遲緩和成活率降低[30-31]。已有研究表明，PP2C在調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激過程中具有重要作用[4]。在哺乳動物細胞中，PP2Cα和PP2Cβ通過對絲裂原活化的蛋白激酶脫磷酸抑制JNK和P38信號的傳導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)應(yīng)激活化的MAPK信號通路[14]。Fan等[32]通過研究MAPK分支通路MAPKK在斑節(jié)對蝦96 h急性低鹽脅迫中的表達模式發(fā)現(xiàn)，斑節(jié)對蝦可通過調(diào)節(jié)肝胰腺和鰓組織中的PmMAPKK的表達來應(yīng)對外界應(yīng)激。此外，MAPK通路多基因MKK7、MKK3、p38MAPK等也已被證實參與水生甲殼動物肝胰腺和鰓組織的先天性免疫應(yīng)激和調(diào)節(jié)過程[13,33-34]。PP2C是MAPK信號通路的重要基因[9,35]，因此，本研究推斷PmPP2C可能參與了斑節(jié)對蝦的急性應(yīng)激過程。

研究表明，鹽度改變會導(dǎo)致對蝦體內(nèi)各種非特異性免疫及滲透相關(guān)酶活性改變，致使對蝦免疫力下降。隨著養(yǎng)殖水體鹽度降低，病原菌對斑節(jié)對蝦的感染力增加，斑節(jié)對蝦對病原菌的耐受性不斷減弱[17]。本研究中96 h急性低鹽脅迫實驗結(jié)果顯示，在兩種低鹽脅迫下，肝胰腺和鰓組織PmPP2C的表達量均下調(diào)，其中鰓組織中PmPP2C表達量在48 h后逐漸上調(diào)并趨于穩(wěn)定，肝胰腺中的表達量 (除低濃度組第12和第24小時) 始終被抑制。研究表明斑節(jié)對蝦PmPP2C可能具有和哺乳動物相似的調(diào)節(jié)，參與調(diào)節(jié)應(yīng)激活化的MAPK信號通路，從而使斑節(jié)對蝦能夠耐受低鹽等極端環(huán)境因子的脅迫[14]。而水中氨氮濃度過高，可導(dǎo)致甲殼動物耗氧率增加、體內(nèi)滲透壓及免疫力下降、代謝紊亂和生長緩慢，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。Luo等[36]研究表明，AMPK作為能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，可通過AMPK-MAPK級聯(lián)參與滲透應(yīng)激和氧化應(yīng)激等激活的能量代謝過程，在外源急性應(yīng)激過程中具有重要作用。Davie等[25]研究哺乳動物肝癌細胞在氮應(yīng)激中的機制發(fā)現(xiàn)，AMPKαSsp2激活可能是通過抑制某種AMPK磷酸激酶來實現(xiàn)的，而PP2C可能作為AMPKαSsp2活性負調(diào)節(jié)因子被抑制。本研究表明，斑節(jié)對蝦在96 h急性氨氮脅迫初期PmPP2C表達量普遍顯著低于對照組，可能是受到了激活的AMPK抑制。Davie等[25]研究指出，激活的AMPK誘導(dǎo)細胞生長停滯，可通過PP2C脫磷酸使細胞恢復(fù)生長，這也可能是本研究中斑節(jié)對蝦急性應(yīng)激中后期PmPP2C表達量升高的原因。