離蕊金花茶花粉活力測定、培養(yǎng)基篩選及貯藏研究

陳菊艷， 鄧倫秀， 黃郎， 徐超然， 劉曉慧

(貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005)

金花茶組(Camelliasect.nitidissima chang)植物屬于山茶科(Theceae)山茶屬(Camellia)，是我國及世界珍稀物種，已被列入國家Ⅱ級保護(hù)植物和《國際生物多樣性公約》附屬Ⅱ物種[5]。其花色呈金黃色，微芳香，觀賞性極高，除此之外，金花茶的花具有抗癌、抗衰老、降低膽固醇和提高機(jī)體免疫力等功能，是傳統(tǒng)的中藥材[6]，可制成茶葉和保健品，一些種已被開發(fā)成花茶，且售價昂貴，市場供不應(yīng)求[7]，具有較高的藥用、觀賞和經(jīng)濟(jì)價值，開發(fā)利用價值極高。多數(shù)種類分布區(qū)域狹窄，野外資源稀少，花和果實易遭蟲害，限制了金花茶的開發(fā)利用，且被列為瀕危植物[7]。離蕊金花茶(Camellialiberofilamenta)[1-4]是金花茶組的物種之一，是唯一分布于貴州的金花茶組的植物，目前，對離蕊金花茶的研究主要集中在形態(tài)解剖與分類、種苗繁育、代用茶等方面，對其花粉貯藏特性研究尚未有報道。對離蕊金花茶花粉生活力及花粉貯藏條件進(jìn)行相關(guān)研究，可有效解決花期不遇、遠(yuǎn)距離雜交等林木遺傳問題[8]。本試驗以離蕊金花茶花粉為材料，對其活力測定方法、花粉培育基和貯藏條件進(jìn)行研究，為該種的雜交育種及其花粉資源保存等研究提供一定參考和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

離蕊金花茶生長在林下、溝邊或溝兩側(cè)斜坡上(24°40＇40″N、106°00＇14″E，海拔620～720 m)。觀察研究的群體于1995年采集種子引種到貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，播種育苗后栽培于闊葉林林下，現(xiàn)已經(jīng)開花結(jié)果10余年，并且無性繁殖苗也已經(jīng)開花結(jié)果。選取種群中發(fā)育正常、長勢較好、具代表性的離蕊金花茶各7株為研究對象，進(jìn)行編號、掛牌、定位，觀測其開花情況。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉收集方法

在同一時間隨機(jī)選取發(fā)育程度相同而又處在不同狀態(tài)下的花，分為花苞待開、花開一半、完全盛開、盛開后1 d、盛開后2 d等5個不同的花期，每個花期各選5朵進(jìn)行花粉采集，在早上9點以前采集當(dāng)天開放的花朵裝入硫酸紙袋中，放入25～30 ℃的室內(nèi)陰干，待花藥大量爆裂之后收集花粉，將采集的花粉混合均勻后，裝入加有干燥硅膠的小玻璃瓶中，及時染色后測定其活力。

1.2.2 花粉活力測定方法

本試驗采用I2-KI染色法[9]、TTC染色法[9]、花粉萌發(fā)法[10]進(jìn)行花粉活力測定(以花粉萌發(fā)率為測定標(biāo)準(zhǔn))，其中前兩種方法為花粉活力的快速測定法。

3種檢測方法置于低倍顯微鏡下，觀測視野中總花粉粒及顯紅色(粉紅色)花粉粒數(shù)目，每樣做3個平行玻片，每玻片選取5個花粉粒分布均勻且花粉粒數(shù)目不少于50粒的視野進(jìn)行統(tǒng)計。凡被染成紅色的花粉，其活力強(qiáng)視為可育花粉，淡紅色次之，無色為沒有活力或不育花粉。

花粉活力百分比=可育花粉粒數(shù)/觀察花粉粒總數(shù)×100%。

1.2.3 不同培養(yǎng)基中花粉的萌發(fā)率測定

按試驗設(shè)計(表1)配置液體培養(yǎng)基，選取TTC檢測活力最高時期的花粉，用不同液體培養(yǎng)基進(jìn)行液體培養(yǎng)檢測花粉活力。將液體培養(yǎng)基取一滴滴至凹槽載玻片上，將花粉蘸取到液體培養(yǎng)基上，置于28 ℃條件下培養(yǎng)4 h后，在顯微鏡下觀察，花粉管長出并超過花粉粒直徑記為有活力，花粉管沒有長出或雖然長出但沒有超過花粉粒直徑大小則記為無活力，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，花粉萌發(fā)率=(已發(fā)芽的花粉數(shù)/花粉?？倲?shù))×100%。

表1 花粉萌發(fā)率試驗設(shè)計

1.2.4 不同貯藏條件花粉的萌發(fā)率

將花粉活力最好時期的花粉，分別保存在-20 ℃、4 ℃和常溫的條件下，之后，將花粉均勻涂抹在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、10 d、15 d、30 d、50 d分別測定各個貯藏條件下的花粉萌發(fā)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，通過Duncan檢驗進(jìn)行差異顯著分析(p<0.05)，圖表采用Excel進(jìn)行制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測定方法測定花粉活力

TTC染色法和I2-KI染色法測定的離蕊金花茶花粉萌發(fā)率明顯高于花粉萌發(fā)法，差異達(dá)到極顯著水平(表2)。I2-KI法和TTC法染色后的花粉粒部分為紅色，表明花粉活力很強(qiáng)，部分為粉色，表明花粉活力一般，還有一部分為白色，表明花粉失活，因此，I2-KI法和TTC法都可以用于離蕊金花茶花粉活力的測定。

表2 不同測定方法下花粉萌發(fā)率(%)

2.2 不同發(fā)育時期離蕊金花茶花粉活力

花粉具有活性是保證植物能正常授粉受精的關(guān)鍵和基本前提，較高的花粉存活率具有較高的萌發(fā)率，可為離蕊金花茶傳粉結(jié)實提供可育的雄配子。離蕊金花茶一般在10月中下旬進(jìn)入盛花期，每朵花的花期約4～6 d，不同時期開花狀態(tài)見圖1，利用TTC法對5個不同時期花粉活力進(jìn)行簡單快速測定，結(jié)果見表3，不同花期狀態(tài)下，離蕊金花茶的花粉存活率差異顯著?；ɡ倨?，離蕊金花茶花粉活力僅0.53%；雄蕊初露期花粉活力逐漸升高，平均值54.95%；花瓣展開期即開花初期，花粉活力迅速上升，平均值達(dá)94.64%；在花朵完全盛開時活力最強(qiáng)，平均值達(dá)96.17%；隨后呈現(xiàn)出降低的趨勢，枯萎凋謝期即在花朵完全盛開1 d后，此時花粉逐漸散去，但仍然保持較高活力，平均值達(dá)到83.60%?？偟膩碚f，離蕊金花茶花粉存活率均隨距離花朵完全盛開時間的增加而呈現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，即花粉存活率隨花朵距離完全開放的時間越近花粉活力越高，待花朵完全開放1 d后，花粉存活率開始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，表明離蕊金花茶花朵完全盛開至1 d內(nèi)，其花粉能保持較高的存活率。同時，這個階段也是昆蟲開展傳粉最佳時期，說明花粉活力與單花發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)。

表3 不同開花時期花粉活力

圖1 不同時期開花狀態(tài)

2.3 不同培養(yǎng)基對花粉萌發(fā)率的影響

對添加有不同質(zhì)量濃度硼酸與蔗糖的培養(yǎng)基上離蕊金花茶花粉萌發(fā)情況進(jìn)行觀測，結(jié)果見表4。從表中可以看出，不同質(zhì)量濃度的硼酸和蔗糖處理均能促進(jìn)花粉的萌發(fā)，在7號處理中花粉萌發(fā)率為63.88%，極顯著高于3號、6號處理，與其他各處理間差異則不顯著。從表5方差分析結(jié)果可見，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硼酸與蔗糖的培養(yǎng)基對實驗結(jié)果有顯著性影響(P<0.05)。經(jīng)不同培養(yǎng)基篩選，以7號液體培養(yǎng)基的花粉活力最高，說明7號培養(yǎng)基最適合作為離蕊金花茶花粉活力的檢測，培養(yǎng)基配比為1%瓊脂+100 mg/L硼酸+200 g/L蔗糖。

表4 不同液體培養(yǎng)基下花粉萌發(fā)率

續(xù)表4 不同液體培養(yǎng)基下花粉萌發(fā)率

表5 不同花粉培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)情況的方差分析

2.4 不同貯藏條件對花粉活力的影響

由表6可以看出，常溫環(huán)境下，離蕊金花茶花粉貯藏2 d后花粉活力下降為50.13%，貯藏10 d后花粉活力為0.56%，貯藏15 d后活力為0，最先失去活力，花粉活力下降最快；4 ℃貯藏條件下，離蕊金花茶花粉貯藏4 d后活力下降到44.78%，貯藏15 d后花粉活力為5.63%，30 d后活力為0；在-20 ℃貯藏條件下，前期離蕊金花茶花粉萌發(fā)率下降速率較緩，表明在這種條件下，有利于離蕊金花茶花粉短期貯藏，貯藏30 d后活力仍然保持在8.27%，一直到貯藏50 d后才失去活力。

表6 不同貯藏方法下花粉活力

續(xù)表6 不同貯藏方法下花粉活力

由以上結(jié)果可初步得出，在-20 ℃冷凍條件下離蕊金花茶的花粉能貯藏更長的時間，在1個月左右，有利于進(jìn)行離蕊金花茶的遠(yuǎn)緣雜交。

3 討論與結(jié)論

花粉活力的研究為雜交育種過程中選配優(yōu)良授粉品種和解決雌雄花期不遇提供重要依據(jù)，其中花粉活力高是授粉成功的重要保證?；ǚ刍盍﹁b定方法目前有兩類，即染色法與離體萌發(fā)法[11]，染色法因具有操作簡單、方便快速，無需特別的外界輔助條件的特點，能在短時間內(nèi)測定花粉活力，但結(jié)果受內(nèi)外多種因素影響較大。離體萌發(fā)法判斷花粉生活力的標(biāo)準(zhǔn)為觀察是否有花粉管萌發(fā)，其更為直觀，但需要摸索離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)條件，因此不同植物花粉生活力的測定只能選用特定的方法[12]。本研究中離蕊金花茶花粉活力測定所選擇的I2-KI染色法、TTC染色法，測定結(jié)果均比花粉萌發(fā)法理想得多，因而這兩種測定方法可以作為離蕊金花茶花粉活力快速檢測的方法。

確定花粉的最佳采集期，以保證其最高水平的成熟度，是決定貯藏后花粉活力能否保持較高水平以及后續(xù)雜交育種能否成功的關(guān)鍵[13]。選用花粉活力高的花粉作為父本可有效提高種子的產(chǎn)量與質(zhì)量，并為種子園配置及更新提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)花瓣展開期和盛花期花粉活力最高，因此，在離蕊金花茶人工授粉時，建議選擇花瓣展開期和盛花期的花朵采集花粉，隨采隨授，即離蕊金花茶在開花前1d和開花當(dāng)天采摘花粉活力較高的雄蕊后，立即取下花粉，采用合適的工具盡快授粉，以提高授粉率。

本試驗中，1%瓊脂+100 mg/L硼酸+200 g/L蔗糖的離蕊金花茶花粉培養(yǎng)基培養(yǎng)的花粉萌發(fā)率最高，達(dá)到63.88%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于3號、6號處理，也高于1號、2號、4號、5號、8號、9號處理，在9個培養(yǎng)基中最適合離蕊金花茶花粉萌發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度蔗糖的花粉培養(yǎng)基培養(yǎng)離蕊金花茶花粉萌發(fā)率是不同的，200 g/L蔗糖有利于花粉的萌發(fā)，是否更高濃度蔗糖對離蕊金花茶花粉萌發(fā)效果更好，有待進(jìn)一步研究。硼元素在植物花期對花藥成熟和花粉管萌發(fā)有很重要的輔助作用，可以促進(jìn)糖的吸收代謝，在一定程度上影響關(guān)鍵酶活性，改變細(xì)胞壁延展性以致影響花粉管細(xì)胞壁的構(gòu)建[14]。當(dāng)蔗糖濃度相同時，隨硼酸濃度升高花粉活力依次下降，可見硼酸發(fā)揮作用需要適宜的蔗糖濃度，兩者存在交互作用，而蔗糖的濃度影響占主導(dǎo)地位，這與顧亞東等[15]和胡新軍等[16]的研究結(jié)果一致。

花粉能夠保持受精時間長度的能力被稱為花粉活力，它受到內(nèi)因與外因的影響，其中溫度變化和貯藏時間是影響花粉活力的重要外因[17-19]。溫度變化和貯藏時間對花粉生活力有影響，不同溫度作用下可促進(jìn)花粉萌發(fā)或延長花粉貯藏時間，在低溫狀態(tài)下貯藏植物花粉，活力降低會相對緩慢，貯藏時間越長，花粉活力則越容易降低[20-22]。由實驗結(jié)果可知，離蕊金花茶花粉貯藏在-20 ℃溫度條件下可適當(dāng)延長花粉生活力，保存時間在1個月左右，這為解決育種授粉活動中有關(guān)花期不遇的問題提供了有價值的參考。

綜上，本實驗研究了離蕊金花茶花粉活力測定的方法、在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)表現(xiàn)以及在三種貯藏溫度下的活力對比，可為指導(dǎo)離蕊金花茶種子園的營建、花粉管理、種質(zhì)創(chuàng)新利用等提供科學(xué)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的研究方向為離蕊金花茶與其他種間雜交組合的親合度及對座果率、種子質(zhì)量的影響。