L-半胱氨酸快速綠色提取稻米中汞形態(tài)的前處理方法研究

陳 曦， 周明慧， 王松雪， 張潔瓊， 田 巍， 伍燕湘

(國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037)

水稻是世界半數(shù)人口的主要糧食作物，我國(guó)有65%的人口以大米為主食[1]，其安全性對(duì)我國(guó)居民的健康有重要影響。由于特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，水稻比其他作物更易富集重金屬，并可將毒性較弱的元素形態(tài)轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的形態(tài)[2, 3]。稻米是人體甲基汞暴露的重要途徑，特別是汞污染礦區(qū)居民甲基汞暴露的主要途徑[4]。甲基汞作為毒性最強(qiáng)的汞化合物，主要具有神經(jīng)毒性，并具有很高的生物蓄積性，進(jìn)入人體后可穿越血腦屏障，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生永久性損傷[5, 6]。因此，對(duì)稻米中的汞形態(tài)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)尤為重要。

在元素形態(tài)分析中，樣品提取是最重要的步驟。GB 5009.17—2014中規(guī)定食品中甲基汞的提取劑為5 mol/L鹽酸，樣品浸泡過(guò)夜后使用超聲水浴提取1 h，期間需振搖數(shù)次，且在上機(jī)檢測(cè)前需調(diào)節(jié)提取液pH，此過(guò)程溫度控制不當(dāng)極易造成低溫汞化合物的損失[7]。對(duì)于甲基汞的提取，目前提取液基本依賴酸或堿性提取介質(zhì)，提取方式大多為超聲水浴、水蒸氣蒸餾或固相微萃取等[8]，提取過(guò)程同樣復(fù)雜耗時(shí)；對(duì)比酸提取，堿性介質(zhì)提取所需時(shí)間更長(zhǎng)，并且在甲基汞含量較低時(shí)存在復(fù)雜的基體效應(yīng)[9]。由此可見(jiàn)，常規(guī)汞形態(tài)檢測(cè)方法的前處理過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)中消耗大量的強(qiáng)腐蝕性酸堿，無(wú)法準(zhǔn)確定量無(wú)機(jī)汞，難以適應(yīng)大批樣品高通量綠色快速檢測(cè)的需求。故在檢測(cè)分析中，開發(fā)快速簡(jiǎn)便綠色的汞形態(tài)提取方法是當(dāng)前行業(yè)急需解決的科研難題。

重金屬化合物在稻米樣品中與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，采用含有相關(guān)配體或功能基團(tuán)的酸性試劑能夠提取某些元素[10]?；诖?，本研究選擇對(duì)人體和環(huán)境無(wú)危害的L-半胱氨酸作為提取劑，利用高效率的超聲破碎方法提取稻米中的汞形態(tài)，樣品無(wú)需浸泡過(guò)夜，15 min即可完成提取，提取完成后可直接上機(jī)檢測(cè)。本研究通過(guò)對(duì)L-半胱氨酸濃度及超聲破碎提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了稻米中汞形態(tài)的快速綠色提取方法。所開發(fā)方法無(wú)需強(qiáng)腐蝕性酸堿試劑，常溫完成提取過(guò)程，后續(xù)無(wú)需調(diào)節(jié)pH和定容，明顯降低汞化合物的揮發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，全面提高稻米中汞形態(tài)的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，同時(shí)降低檢測(cè)成本，為目前糧食行業(yè)精準(zhǔn)檢測(cè)谷物中汞形態(tài)提供一種強(qiáng)有力的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

汞元素天然污染糙米和大米樣品由國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院實(shí)地扦取提供。

L-半胱氨酸(98.5%)；GBW08617汞單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、GBW(E)083364甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純)；硼氫化鉀、氫氧化鉀和過(guò)硫酸鉀(優(yōu)級(jí)純)。

1.2 儀器與設(shè)備

950E超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，BAS-100A型液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀(配有汞空心陰極燈)，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6×150 mm, 5 μm)，Milli-Q超純水處理系統(tǒng)，3-30K高速離心機(jī)，Pulverisette 14粉碎機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

稻米樣品經(jīng)粉碎機(jī)研磨至過(guò)60目(0.25 mm)樣品篩，先在離心管中加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%L-半胱氨酸溶液，稱取0.500 g均勻樣品后，再加入2.5 mL 1%L-半胱氨酸溶液，混勻；設(shè)置超聲破碎功率為150 W，超聲時(shí)間15 min，提取完成后8 000 r/min離心5 min，吸取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜后使用液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用方法(LC-AFS)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 對(duì)比方法

稱量均勻稻米樣品0.500 g，按照GB 5009.17—2014標(biāo)準(zhǔn)方法第二篇規(guī)定的試樣提取方法進(jìn)行前處理，使用LC-AFS測(cè)定其中的無(wú)機(jī)汞和甲基汞。

1.3.3 儀器條件

液相色譜條件：流動(dòng)相：5%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.1%L-半胱氨酸；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：100 μL。

原子熒光光譜條件：負(fù)高壓：280 V；汞燈電流：30 mA；原子化器溫度：200 ℃；載氣流速：400 mL/min；屏蔽氣流速：800 mL/min；載流：5%HCl；還原劑：0.5%KOH+0.2%KBH4；氧化劑：0.2%K2S2O8。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑濃度優(yōu)化

GB 5009.17—2014中使用鹽酸作為提取劑，為兼顧C(jī)18色譜柱耐受的pH環(huán)境(pH為2～7)，樣品提取液在上機(jī)檢測(cè)前需調(diào)節(jié)pH，鹽酸提取劑的濃度為5 mol/L(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為40%)，酸度極大，在調(diào)節(jié)pH時(shí)不僅需耗費(fèi)較多堿液，還會(huì)增加待測(cè)樣品被污染的風(fēng)險(xiǎn)；若調(diào)節(jié)不當(dāng)使得溶液偏酸，如調(diào)節(jié)后的pH剛好處于色譜柱耐受條件的下限，約為2.0，則導(dǎo)致無(wú)機(jī)汞和甲基汞色譜峰分離度極差，無(wú)法定量，見(jiàn)圖1；同時(shí)在調(diào)節(jié)pH過(guò)程中應(yīng)注意控制溫度，緩慢逐滴加入堿液，或?qū)⑻崛∫褐糜诒≈胁僮?，因?yàn)榇罅克釅A中和會(huì)產(chǎn)生更多熱量，熱量來(lái)不及擴(kuò)散會(huì)使溶液溫度很快升高導(dǎo)致低溫汞形態(tài)損失，使得無(wú)機(jī)汞和甲基汞的加和數(shù)據(jù)低于總汞測(cè)定結(jié)果，如圖2所示。

圖1 pH調(diào)節(jié)偏酸情況下無(wú)機(jī)汞和甲基汞色譜峰的分離度(pH≈2.0)

圖2 pH調(diào)節(jié)溫度控制不當(dāng)導(dǎo)致無(wú)機(jī)汞損失(堿液加入速度過(guò)快)

L-半胱氨酸為一種含巰基、氨基和羧基的陽(yáng)離子多基配體，水溶液呈酸性，對(duì)汞元素有較強(qiáng)的螯合能力[11, 12]，具有生物相容性，其安全性已通過(guò)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)的安全認(rèn)證[13]。故本研究選擇L-半胱氨酸作為稻米中汞形態(tài)的提取劑，前期測(cè)試結(jié)果顯示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%L-半胱氨酸的pH約為2.0，結(jié)合C18色譜柱適宜的pH范圍2～7，設(shè)置提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.3%、0.5%、1%、1.5%、2%和3%，固定超聲破碎功率為200 W，超聲時(shí)間為15 min，以汞天然污染糙米樣品(YN-378)作為測(cè)試樣品，總汞定值為(0.018±0.001 5)mg/kg，提取劑濃度優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 L-半胱氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)不同汞形態(tài)提取結(jié)果的影響(n=3)

提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.5%，糙米樣品中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的提取結(jié)果均隨著L-半胱氨酸濃度的增加而呈上升趨勢(shì)；提取劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～3%，2種汞形態(tài)的提取結(jié)果保持穩(wěn)定，汞形態(tài)加和結(jié)果符合總汞定值范圍，故選擇1%L-半胱氨酸作為稻米中汞形態(tài)的提取劑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明稻米中汞元素的提取基本依賴巰基配體和低酸環(huán)境，初步證實(shí)谷物中汞的主要存在形態(tài)為硫化物結(jié)合態(tài)。

2.2 超聲破碎參數(shù)優(yōu)化

GB 5009.17—2014中規(guī)定食品中甲基汞的提取方式為超聲水浴法，常用儀器為超聲波清洗器。本研究在前期摸索中發(fā)現(xiàn)，該儀器受自身功率所限，提取效率低，導(dǎo)致提取時(shí)間長(zhǎng)，并需在過(guò)程中振搖數(shù)次，提取結(jié)果受人為因素影響大。另外，超聲波清洗器需要液體作為超聲波傳導(dǎo)介質(zhì)，在運(yùn)行過(guò)程中產(chǎn)生的噪聲較大，長(zhǎng)時(shí)間操作影響實(shí)驗(yàn)人員健康。另一種具有超聲波提取功能的設(shè)備為超聲波細(xì)胞破碎儀，該儀器功率大，能夠有效減少提取時(shí)間，且配備的隔音箱可以降低工作過(guò)程中發(fā)出的噪聲。本研究試圖使用超聲波細(xì)胞破碎儀提取稻米中的汞形態(tài)，通過(guò)優(yōu)化超聲破碎方法參數(shù)，確定提取條件。

以YN-378作為測(cè)試樣品，根據(jù)提取劑濃度優(yōu)化結(jié)果，固定提取劑為1%L-半胱氨酸溶液，超聲時(shí)間為15 min，參考儀器工程師推薦條件，設(shè)置超聲破碎功率分別為80、100、120、150、180、200 W，超聲功率優(yōu)化結(jié)果如圖4所示。

超聲功率為120～200 W時(shí)，YN-378糙米樣品中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的提取結(jié)果不隨超聲功率的變化而發(fā)生明顯變化，汞形態(tài)加和結(jié)果與總汞定值范圍基本一致，故選擇150 W作為超聲功率提取條件。因此，固定提取劑為1%L-半胱氨酸溶液，超聲破碎功率為150 W，設(shè)置超聲時(shí)間為3、5、10、15、20、30 min，摸索超聲時(shí)間對(duì)不同汞形態(tài)提取結(jié)果的影響。

從圖5可以觀察出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，不同汞形態(tài)的提取結(jié)果逐漸增加，至10 min時(shí)趨于穩(wěn)定，2種汞形態(tài)加和結(jié)果接近總汞定值中值?；诖耍曁崛r(shí)間應(yīng)設(shè)定為15 min。

2.3 方法比對(duì)

以實(shí)地扦取的汞天然污染糙米樣品YN-378、NM-005及大米樣品LD-045作為測(cè)試樣品，將本方法與GB 5009.17—2014進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證本方法測(cè)定不同稻米樣品中汞形態(tài)的準(zhǔn)確度。由表1可知，1%L-半胱氨酸搭配超聲破碎作為前處理方式對(duì)稻米樣品中甲基汞的提取結(jié)果與GB 5009.17—2014方法基本一致，經(jīng)檢驗(yàn)，2種方法對(duì)甲基汞的提取結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05)。但本方法對(duì)于無(wú)機(jī)汞的檢測(cè)結(jié)果明顯高于國(guó)標(biāo)方法，汞形態(tài)加和結(jié)果也與總汞檢測(cè)數(shù)據(jù)一致，而使用GB 5009.17—2014檢測(cè)的汞形態(tài)加和普遍低于總汞定值范圍。由此證實(shí)借助超聲破碎提取方式，1%L-半胱氨酸可準(zhǔn)確提取稻米樣品中的不同汞形態(tài)。

表1 本方法測(cè)定稻米樣品中汞形態(tài)的準(zhǔn)確度/mg/kg

2.4 汞形態(tài)間轉(zhuǎn)化考察

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察本方法提取稻米樣品汞形態(tài)過(guò)程中無(wú)機(jī)汞和甲基汞是否發(fā)生形態(tài)間轉(zhuǎn)化，加標(biāo)水平均設(shè)在50%樣品汞形態(tài)含量左右，結(jié)果見(jiàn)表2。本方法對(duì)于稻米樣品中無(wú)機(jī)汞的加標(biāo)回收率為97.2%～104.2%，甲基汞的加標(biāo)回收率為97.4%～101.8%，數(shù)據(jù)結(jié)果證實(shí)在前處理過(guò)程中不同汞形態(tài)間沒(méi)有發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化。

表2 LC-AFS方法加標(biāo)回收率

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

使用LC-AFS方法檢測(cè)稻米中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的提取結(jié)果，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中2種汞形態(tài)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)色譜響應(yīng)值S/N=3∶1計(jì)算檢出限，方法學(xué)參數(shù)如表3所示。本方法檢出限、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍滿足行業(yè)日常檢測(cè)所需，線性相關(guān)系數(shù)良好。

表3 本研究方法學(xué)參數(shù)

選取糙米樣品YN-378作為測(cè)試樣品，平行測(cè)定6次，無(wú)機(jī)汞和甲基汞的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，證實(shí)本方法精密度良好。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)提取劑濃度及超聲破碎方法參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了L-半胱氨酸超聲破碎提取-液相色譜-原子熒光光譜精準(zhǔn)測(cè)定稻米樣品中無(wú)機(jī)汞和甲基汞的快速方法。樣品前處理過(guò)程無(wú)需使用酸堿和有機(jī)試劑，對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員友好，操作簡(jiǎn)單，15 min完成提取，過(guò)程中不發(fā)生形態(tài)間轉(zhuǎn)化。本方法對(duì)甲基汞的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法無(wú)顯著性差異(P>0.05)，同時(shí)對(duì)無(wú)機(jī)汞的檢測(cè)準(zhǔn)確度更高，方法檢出限和精密度滿足檢測(cè)要求，適用于大批量稻米樣品中汞形態(tài)的測(cè)定。