陳米中蛋白質(zhì)對淀粉顆粒間解聚集的影響

董 鵬, 郭玉寶, 朱世民, 宋 睿, 寧俊帆

(安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，蕪湖 241000)

大米作為主要口糧，養(yǎng)活了全球65%以上的人口[1]，是人體所需碳水化合物和多種營養(yǎng)素的主要來源。為了口糧的周年供應(yīng)和糧食安全，稻米儲藏是十分必要的。然而，稻谷不耐儲藏。不管是稻谷還是大米，儲藏中均會發(fā)生陳化，引起品質(zhì)劣變，但陳化劣變的機(jī)理仍不清楚。

大米陳化劣變與非淀粉組分的變化密切相關(guān)[2,3]，如胚乳細(xì)胞壁和蛋白質(zhì)的變化、蛋白質(zhì)之間的相互作用、脂質(zhì)氧化的分解產(chǎn)物及淀粉與蛋白質(zhì)之間的相互作用，但是非淀粉組分影響淀粉糊化的途徑尚不清楚。直鏈淀粉與脂類形成包合物可降低淀粉的酶解敏感性和溶脹能力，但是脫脂并未阻止陳化[4]。大米儲藏中蛋白質(zhì)總量基本不變，巰基減少，二硫鍵增多，這使得米飯的硬度增大，黏性減小[5]。劉桃英等[6]發(fā)現(xiàn)，添加一定量的大米蛋白后，米粉的溶脹性、峰值黏度、谷值黏度、崩解值和最終黏度降低，糊化溫度、回生值、峰值時間和熱焓值增加，表明大米蛋白對淀粉的糊化有抑制作用。去除米粉中的醇溶蛋白后，衰減值顯著減小[7]，峰值黏度、崩解值和最終黏度都顯著增大[8]。

蛋白質(zhì)和脂質(zhì)對陳化的影響研究，有考察淀粉糊化宏觀指標(biāo)——黏度的變化，或考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和狀態(tài)的變化，而對陳化中蛋白質(zhì)影響淀粉糊化的微觀途徑很少涉及，蛋白質(zhì)影響淀粉糊化的過程機(jī)制仍不清楚。米粒中蛋白質(zhì)含量分布不均，米粒外層富含蛋白；而且大米儲藏中米粒外層暴露于空氣中，陳化變化更明顯。因此，本文以富含蛋白的米粒外層為研究對象，通過逐一脫除各蛋白研究其對淀粉糊化粒度分布和顯微形態(tài)的影響，以新米為對照，比較新米與陳米之間在各蛋白脫除后的差異，從而揭示陳化中蛋白質(zhì)對淀粉糊化微觀變化的影響，有助于闡明稻米陳化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大米：粳型新谷新米，初始含水量為(14.08±0.07)%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

正己烷、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇(均為分析純)。

1.3 儀器與設(shè)備

JGMJ8090稻谷精米檢測機(jī)，MS2000激光粒度分析儀，S-4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，LW200CA光學(xué)顯微鏡，LGJ-12真空冷凍干燥機(jī)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大米儲藏及米粉的制備

將大米分成兩份，分別裝入250 mL廣口瓶中，將瓶口涂上凡士林，并用保鮮膜包覆密封，一份在4 ℃下貯存保鮮，作為對照[5]；另一份置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中儲藏12個月，獲得陳米[9]。利用精米機(jī)對大米進(jìn)行剝蝕碾磨，通過控制碾米時間，獲得米粒外層米粉(碾削質(zhì)量占米粒質(zhì)量的15%)，過40目篩，篩下物[新米和陳米蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(8.12±0.24)%和(8.08±0.43)%]裝自封口袋在4 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 脂肪和各蛋白的脫除

脫脂、脫蛋白流程如圖1所示。為減少脂肪對脫蛋白的影響，預(yù)先用正己烷脫脂[4]。根據(jù)大米中清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白在不同溶劑中的溶解性不同，參考Osborne經(jīng)典方法逐一提取各蛋白[10]。具體如下：稱取40 g新米米粉(F0)，用4倍正己烷在25 ℃脫脂1 h，抽濾，沉淀在室溫?fù)]發(fā)24 h，得脫脂米粉(F1)。取40 g脫脂米粉，用4倍蒸餾水脫除清蛋白，離心后沉淀凍干，得脫清蛋白殘基(F2)；用蒸餾水脫除清蛋白所得沉淀，再用5% NaCl脫球蛋白，經(jīng)水洗、離心后沉淀凍干，得脫球蛋白殘基(F3)；脫球蛋白所得沉淀，再用0.1 mol/L的NaOH脫谷蛋白，經(jīng)鹽酸中和及水洗后沉淀凍干，得脫谷蛋白殘基(F4)；脫谷蛋白所得沉淀，再用70%乙醇脫除醇溶蛋白，經(jīng)水洗、離心后沉淀凍干，得脫醇溶蛋白殘基，即粗淀粉[11][F5，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.21±0.03)%]。每個脫除步驟重復(fù)2次。類似地，以陳米米粉(A0)為原料，經(jīng)相同處理，分別得到陳米脫脂米粉(A1)、陳米脫清蛋白殘基(A2)、陳米脫球蛋白殘基(A3)、陳米脫谷蛋白殘基(A4)和陳米脫醇溶蛋白殘基[A5，即陳米粗淀粉，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.26±0.04)%]。各個蛋白脫除后，所得殘基置于自封口袋于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 脫脂脫蛋白流程圖

1.4.3 粒度分布測定

稱取0.2 g樣品于試管中，加入10 mL蒸餾水，渦旋使其分散均勻后靜置10 min，然后放入75 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min(過高溫度會黏連成膠凝化態(tài))，取出后放置在50 ℃的恒溫水浴鍋中保溫，防止其老化。采用激光粒度分析儀測定粒度，分析條件：分散劑為水，儀器轉(zhuǎn)速為1 800 r/min，超聲分散，加樣使遮光度為10%～20%，每個樣品平行測定5次，取平均值[12]。

1.4.4 組分陳化效應(yīng)及陳化貢獻(xiàn)率的計(jì)算

某組分被脫除前后粒度分布體積分?jǐn)?shù)的變化，代表該組分對粒度分布的影響。對于新米粉及其殘基來說，因?yàn)闆]有發(fā)生陳化，某組分被脫除前后的變化量是由于組分自身存在與否引起的，代表基質(zhì)效應(yīng)(ME)[4]；對于陳米粉及其殘基來說，因?yàn)榘l(fā)生了陳化，某組分被脫除前后的變化量是總效應(yīng)(TE)，既包括組分自身的基質(zhì)效應(yīng)，也包括組分在陳化中發(fā)生的變化引起的陳化效應(yīng)(AE)。因此，各組分對粒度分布的陳化效應(yīng)可以從新、陳米各殘基粒度分布體積分?jǐn)?shù)的變化量(AE=TE-ME)來獲得，而陳化貢獻(xiàn)率是某組分的陳化效應(yīng)占實(shí)際陳化效應(yīng)(從新米到陳米陳化變化量)的比例[4]。

1.4.5 光鏡形態(tài)觀察

樣品處理方法與粒度分布測定時相同。觀察時，先將試管中樣品渦旋震蕩1 min混勻，用吸管取樣滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，觀察并拍照記錄。

1.4.6 掃描電鏡觀察

前期制樣方法與粒度分布中制樣相同，但糊化后將樣品凍干，研成粉末，用導(dǎo)電膠粘在樣品臺上噴金10 nm。加速電壓15 kV，放大3 000倍。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 8.01進(jìn)行ANOVA單因素方差分析及鄧肯多重比較(Duncan’s Multiple Range Test，P<0.05)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪和各蛋白對糊化粒度分布的影響

通過比較脂肪和各蛋白對新米和陳米影響的差異，說明各組分的陳化變化對粒度分布的影響，從而闡明脂肪和各蛋白對陳化后淀粉顆粒間解聚集的影響。從圖2可以看出，新米和陳米的粒度分布有明顯差異(圖2a)，陳米小粒徑峰更低，大粒徑峰更高。小粒徑峰出現(xiàn)在9 μm附近，屬于淀粉顆粒的范圍[13]；大粒徑峰在50 μm附近，屬于胚乳細(xì)胞的范圍[14]，表明陳化使淀粉顆粒間難于解聚。脫去脂肪及4種蛋白以后，所得新米和陳米的粗淀粉粒度分布曲線基本重合(圖2b)，表明脂肪和蛋白質(zhì)在陳化中的變化是陳米粒度分布改變的主要原因。

脂肪和4種蛋白各自對粒度分布的影響結(jié)果如圖2c～圖2l所示。圖2c和圖2d表明，新米中脂肪對粒度分布幾乎沒有影響，而陳米中脂肪的存在明顯促進(jìn)了淀粉顆粒的解聚，因?yàn)殛惷酌撝靶×７迕黠@比脫脂后更高。脫清蛋白后，新米的小粒徑峰明顯增大，大粒徑峰消失(圖2e)；陳米的小粒徑峰也明顯增大，但低于新米，大粒徑峰明顯減小但仍存在(圖2f)，表明清蛋白的存在對新米和陳米中淀粉顆粒間的解聚具有明顯抑制作用，且陳化后的抑制作用更強(qiáng)，可能是陳化后清蛋白水溶性降低所致。新米脫除球蛋白前后，均只有一個小粒徑峰，但脫球蛋白后小粒徑峰升高且峰形變窄(圖2g)；陳米脫球蛋白后，小粒徑峰明顯升高，大粒徑峰趨于消失(圖2h)，顯示出球蛋白對淀粉顆粒的解聚也具有顯著的抑制作用，且陳化后球蛋白的抑制作用明顯更大。

谷蛋白和醇溶蛋白是疏水性蛋白。脫除谷蛋白后，新米的小粒徑峰在一定程度上降低，而峰位粒徑有所增大，說明新米中的谷蛋白對淀粉顆粒的解聚有一定的促進(jìn)作用，而略微抑制了淀粉顆粒的溶脹(圖2i)；陳米脫谷蛋白后，小粒徑峰明顯增大，峰形變窄，大粒徑峰完全消失(圖2j)，表明陳米中的谷蛋白對淀粉顆粒的解聚具有明顯抑制作用。脫除醇溶蛋白后，新米小粒徑峰有所增大(圖2k)；陳米小粒徑峰峰高不變，峰位粒徑略有增加(圖2l)，顯示陳化后醇溶蛋白對淀粉顆粒的解聚影響很小。

對于新米，清蛋白和球蛋白對淀粉顆粒間的解聚具有明顯的抑制作用，谷蛋白有較小的促進(jìn)作用，醇溶蛋白的抑制作用較小，脂肪幾乎沒有影響；對于陳米，清蛋白、球蛋白和谷蛋白對淀粉顆粒間的解聚具有明顯的抑制作用，醇溶蛋白幾乎沒有影響，而脂肪卻有明顯的促進(jìn)解聚作用。這在一定程度上說明，大米陳化中清蛋白、球蛋白和谷蛋白的變化使得淀粉顆粒在糊化中難于解聚。這些分析只是定性的，陳化后各蛋白對淀粉顆粒解聚抑制作用的凈效應(yīng)以及對陳化變化的貢獻(xiàn)程度，有待進(jìn)一步分析。

脂肪和各蛋白對糊化粒度分布的影響見表1。由表1可知，陳米米粉比其脫脂后的小粒徑峰體積百分?jǐn)?shù)明顯更大，表明脂肪的存在明顯促進(jìn)了陳米中淀粉顆粒的解聚，而脫脂對新米的影響在數(shù)值上相對較小。脫清蛋白后，陳米中淀粉顆粒解聚更多，而新米已完全解聚成小顆粒(淀粉顆粒)。

表1 脂肪和各蛋白對淀粉糊化粒度體積分?jǐn)?shù)的影響

圖2 脂肪和各蛋白對淀粉糊化粒度分布的影響

陳米脫球蛋白后，小粒徑峰體積分?jǐn)?shù)顯著增大，脫除谷蛋白后才完全解聚成小顆粒。結(jié)果說明，蛋白質(zhì)對陳米中淀粉顆粒間解聚的抑制作用遠(yuǎn)大于新米，導(dǎo)致陳米比新米中的淀粉顆粒更難解聚，陳米須在谷蛋白脫除后才完全解聚，而新米只需在清蛋白脫除后即可完全解聚。

為了更清楚地說明大米中各蛋白在陳化中的變化對淀粉顆粒間解聚的貢獻(xiàn)，需要在排除各組分自身基質(zhì)效應(yīng)的基礎(chǔ)上，分離出各蛋白對淀粉顆粒間解聚的陳化效應(yīng)，進(jìn)而比較各組分對陳化變化貢獻(xiàn)的大小[4,15]。由表2可知，脂肪、清蛋白和球蛋白的陳化貢獻(xiàn)率絕對值較大，是影響陳米中淀粉顆粒間解聚的主要組分，其中清蛋白和球蛋白明顯抑制了淀粉顆粒的解聚，陳化貢獻(xiàn)率分別為89%和82%；脂肪則對淀粉顆粒的解聚具有明顯的促進(jìn)作用，陳化貢獻(xiàn)率為-75%。谷蛋白對淀粉顆粒解聚的抑制作用很小，醇溶蛋白對淀粉顆粒解聚沒有影響，可能是因?yàn)楣鹊鞍缀痛既艿鞍资鞘杷缘鞍?，吸水溶脹程度低?/p>

表2 大米陳化過程中各組分的陳化效應(yīng)及陳化貢獻(xiàn)率

2.2 脂肪和各蛋白對光學(xué)顯微形態(tài)的影響

從光學(xué)顯微形態(tài)可以看出，從新米中分散出來的小顆粒比陳米中的更多，新米保留下來的大顆粒比陳米更少(圖3a、圖3b)。新米脫脂后(圖3c)，大顆粒比脫脂前(圖3a)變得更?。欢惷酌撝?圖3d)的顆粒分散程度低于脫脂前(圖3b)，體現(xiàn)為脫脂后的大顆粒比脫脂前更大，這與陳米中脂肪促進(jìn)淀粉顆粒間解聚的結(jié)果相一致。新米脫清蛋白后大顆粒明顯變小(圖3e)；陳米脫清蛋白后這一變化更加明顯，即大顆粒明顯變小且數(shù)量更少(圖3f)，這與粒度分析的結(jié)果一致，即大米陳化后清蛋白對淀粉顆粒解聚的抑制作用明顯增強(qiáng)。

新米脫球蛋白后小顆粒變得更小(圖3g)，盡管仍可見少量顆粒聚集，但其可能會在粒度測定中的高度稀釋和攪拌作用下分散成小顆粒；陳米脫球蛋白后，可見的小顆粒更多(圖3h)，這支持陳米中的球蛋白對淀粉顆粒分散具有明顯的抑制作用。在高倍鏡下觀察，脫除谷蛋白后，新米中均為淀粉單粒(圖3i)，而陳米中仍可見少量淀粉復(fù)粒(圖3j)。醇溶蛋白被脫除后，新米和陳米間的淀粉顆粒形態(tài)差異不大，只是新米淀粉顆粒溶脹得更大(圖3k、圖3l)，與粒度分析結(jié)果一致。因此，光學(xué)顯微結(jié)果較好地支持了粒度分析結(jié)果，即清蛋白和球蛋白的存在明顯抑制了淀粉顆粒的解聚，而脂肪則明顯促進(jìn)了陳米淀粉顆粒的解聚。

圖3 脂肪和各蛋白對糊化光學(xué)顯微形態(tài)的影響

2.3 脂肪和各蛋白對掃描電鏡形態(tài)的影響

新米和陳米脫除脂肪和各蛋白后的掃描電鏡如圖4所示，新米中的淀粉顆粒溶脹得較充分，質(zhì)地平滑，蛋白體[16]凸出且溶脹得比陳米中的更大(圖4a)；陳米中的淀粉顆粒溶脹程度相對較低，形態(tài)干癟，蛋白體較小，且鑲嵌在淀粉之中(圖4b)。脫脂后，新米中可見大而深的淀粉顆粒脫落坑(圖4c)；而陳米中的淀粉顆粒脫落坑小而淺(圖4d)。脫除清蛋白后，新米中可見小而深的脫落坑，淀粉顆粒分離坑明顯(圖4e)；而陳米中的淀粉顆粒依然與基質(zhì)黏連在一起(圖4f)。

圖4 脂肪和各蛋白對掃描電鏡形態(tài)的影響

脫球蛋白后，新米中淀粉顆粒脫落坑較多，且更大(圖4g)；而陳米中淀粉顆粒脫落坑比脫球蛋白前明顯增加，但存在較小的脫落坑(圖4h)。脫谷蛋白后，新米中的淀粉顆粒脫落坑更大更深，表明淀粉顆粒溶脹充分(圖4i)；陳米中的淀粉顆粒脫落坑也變深，但較小，說明陳米中的淀粉顆粒獲得分離，但溶脹程度較低(圖4j)。脫醇溶蛋白后，新米和陳米均糊化均較完全，呈凝膠化狀態(tài)，可能是淀粉顆粒解聚完全的結(jié)果(圖4k、圖4l)。

結(jié)果表明，陳米需在脫除球蛋白后可見明顯的淀粉顆粒分離，而新米只需在脫除清蛋白后即可見明顯的淀粉顆粒分離，因此陳米中的淀粉顆粒間更難解聚。此外，陳米中的淀粉顆粒溶脹程度低，蛋白體溶脹得更小，且被淀粉更多包埋，可能是淀粉顆粒難于解聚的原因。

3 結(jié)論

陳米中的脂肪和各蛋白被逐一脫除后，淀粉顆粒間可以充分解聚，與新米間的粒度分布差異消失，光學(xué)顯微結(jié)果支持粒度分布結(jié)果，表明脂肪和蛋白質(zhì)對陳米中淀粉顆粒間的解聚具有重要影響。通過分離大米中各組分的陳化效應(yīng)并計(jì)算陳化貢獻(xiàn)率，發(fā)現(xiàn)清蛋白和球蛋白明顯抑制了陳米中淀粉顆粒間的解聚，其陳化貢獻(xiàn)率分別為89%和82%；而脂肪則對陳米中淀粉顆粒間的解聚具有促進(jìn)作用，陳化貢獻(xiàn)率為-75%；谷蛋白的抑制解聚作用較小，醇溶蛋白幾乎無影響。掃描電鏡顯示，陳米需在脫除球蛋白后方能充分解聚，新米只需在脫除清蛋白后即可；陳米比新米中的淀粉顆粒脫落坑和蛋白體更小，被淀粉包埋更多。因此，清蛋白和球蛋白在陳化中的變化抑制了淀粉顆粒間的解聚，是蛋白質(zhì)影響淀粉糊化的重要途徑。本研究結(jié)果為控制稻米的陳化劣變和產(chǎn)后減損提供了有益思路。