枳椇山楂果酒釀酒工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析

吳雙從，曹新志，張楷正，王 靜，宋澤麗，周安琪

（四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000）

枳椇（Hovenia dulcis）俗名拐棗，因不同于其他水果的奇特造型又名“萬壽果”[1]。枳椇果梗每100 g含粗脂肪74 mg，粗蛋白質3.07 mg，總酸345.8 mg，維生素C（vitamin C，VC）16.29 mg。鮮果中含有豐富的活性多糖、有機酸、鈣、鐵、磷、硒、生物堿等有效有益成分，其富含的糖類物質、氨基酸含量相媲美于葡萄，是優(yōu)質的果酒原料且釀造時間短[2]。釀造的果酒顏色黃綠，營養(yǎng)成分豐富、口感清新香甜、風味俱佳，枳椇鮮果及其深加工產(chǎn)品深受國內外消費者青睞，此外枳椇果梗水提取液具有抗腫瘤，緩解酒精性肝損傷[3]的功效。枳椇果酒作為拓寬枳椇資源利用的重要方式，白小瓊[4]以重慶地區(qū)的野生枳椇果實為主要原料，結合果酒釀酒技術，優(yōu)化了枳椇果酒的發(fā)酵工藝：白砂糖用量18.0%，酵母用量0.15%，發(fā)酵溫度為22 ℃，在此條件下枳椇果酒的酒精度、總酸及總糖含量分別是12.0%vol、7.3 g/L、9.7 g/L，向金環(huán)[5]利用枳椇果實的野生酵母，對果渣和果汁二次自然發(fā)酵，酒放置于溶洞后熟，提高出酒率的同時增加了自然風味；司武陽[6]公開一種枳椇酒精飲料，制備枳椇果汁，添加液體果汁（草莓、蘋果、菠蘿、香蕉等）制成的比例在1～3∶10的復合果汁，在溫度8～11 ℃、5 d的主發(fā)酵和3～4 ℃、4 d的后發(fā)酵得到的一種低酒精度枳椇飲料，風味佳口感好，表明添加其他水果果汁提高了枳椇果酒的品質。

多酚、有機酸、香氣成分的種類和含量是影響果酒品質的重要因素[7]。通過調整原料果汁中多酚、有機酸、香氣成分的種類增加或降低其含量可實現(xiàn)改善果酒品質的目的。將不同水果混合是提高果汁或果酒品質常用方法之一，目前在枳椇復合果酒釀造方面研究較少。山楂高酸低糖且富含多種維生素和黃酮類物質，對心血管系統(tǒng)具有顯著的保健作用[8]，利用山楂復配發(fā)酵的山楂鴨梨[9]、山楂紅棗[10]、蘋果山楂[11]、山楂山藥[12]、山楂龍眼[13]等復合果酒的研發(fā)豐富果酒品類的同時，提高了果酒的感官品質與營養(yǎng)價值。枳椇果汁高糖低酸與山楂汁高酸低糖混合后，糖酸比協(xié)調，口感酸甜且營養(yǎng)豐富，利用山楂來提高枳椇果酒的綜合理化品質，并進行釀造工藝優(yōu)化，旨在豐富枳椇果酒品類，為枳椇復合果酒提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳椇果梗：安徽秦嶺；山楂：市售；商業(yè)釀酒酵母（SP）：安琪股份有限公司；果膠酶（50 000 U/g）：南寧龐博生物技術有限公司；纖維素酶（20 000 U/g）：綿陽禾本生物工程公司；偏重亞硫酸鉀、無水檸檬酸（食品級）：山東省新怡釀酒公司；白砂糖：市售。

NaOH、無水乙醇、Na2CO3、NaNO2、沒食子酸、蘆丁、無水葡萄糖、Al（NO3）3、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、Folin酚：福州飛凈生物科技有限公司。所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PP251美的榨汁攪拌器：廣東美的生活電器制造有限公司；WZ103手持糖度計：成都世紀方舟科技有限公司；SGSP-02電熱恒溫隔水培養(yǎng)箱：武漢天鷹醫(yī)療設備有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；UV-1000型紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；wTB-1003電子天平：杭州萬特衡器有限公司；PHS-25 pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；SW-CJ-1D型單人無菌工作臺：上海瀘凈醫(yī)療器械有限公司；酒精計：石家莊百亨通用儀器儀表制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 枳椇山楂果酒釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

（1）枳椇果汁的制備：選取完全成熟，果梗飽滿且經(jīng)過預處理的果梗添加1.2倍質量的蒸餾水，打漿在高速組織破碎機中破壁2 min。添加0.40%復合酶（果膠酶∶纖維素酶質量比為5∶7）于45.0 ℃、40 W的超聲波環(huán)境中酶解2 h，無菌紗布過濾除去粗纖維質得枳椇果汁。

（2）山楂果汁的制備：參照李慧蕓等[11，14]的方法并稍作修改，山楂凍結10 h破壞細胞壁促進組織液和營養(yǎng)成分溶出、2.0倍山楂質量比的蒸餾水打漿，添加1.0 mL/kg的果膠酶，酶解溫度60 ℃下酶解2.15 h，過濾取汁。

（3）果汁復配：將制備好的枳椇果汁和山楂果汁按照一定的比例混合。

（4）調整糖度、酸度：添加粉碎成粉末狀的白砂糖，調整為需要的枳椇果汁糖度，以無水檸檬酸調節(jié)復配果汁的酸度至4.0以下。

（5）酵母活化與主發(fā)酵：將1.0%的商業(yè)釀酒酵母（SP）置于5%糖度無菌水，在30 ℃活化30 min。無菌環(huán)境下接種于500 mL的三角瓶，裝液量300 mL，于28 ℃條件下恒溫發(fā)酵7 d。

（6）倒罐后發(fā)酵：虹吸倒罐，上清液于低溫條件下后發(fā)酵15 d，即得枳椇山楂果酒。

1.3.2 枳椇山楂果酒釀造工藝優(yōu)化單因素試驗

考察不同山楂汁與枳椇汁體積比（10∶100、20∶100、40∶100、60∶100、80∶100、100∶100）、不同初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%）、酵母接種量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、發(fā)酵溫度（16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃）、發(fā)酵時間（7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）對枳椇山楂果酒發(fā)酵的影響。

1.3.3 枳椇山楂果酒釀造工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，挑選對枳椇山楂果酒發(fā)酵影響較大的因素設計正交試驗，并確定最佳工藝條件組合。正交試驗因素與水平見表1。

表1 枳椇山楂果酒釀造工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Hovenia dulcis and hawthorn wine fermentation process optimization

1.3.4 枳椇山楂果酒質量評價

（1）基本理化指標的測定

總酸含量測定均參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；總酚采用Folin-Ciocalte比色方法測定[15]；酒精度采用重鉻酸鉀氧化法測定[16]；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸法測定[17]；總黃酮采用硝酸鋁比色法測定[18]；可溶性固形物含量采用手持糖度計測定。

（2）枳椇山楂果酒抗氧化活性分析

以0.3%維生素C溶液為陽性對照，測定復合果酒、枳椇果酒的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS+）自由基清除能力和鐵離子還原能力，探究其抗氧化活性。

①DPPH自由基清除率測定：參照金海炎等[19]的測定方法，略作改動，準確稱取0.019 7 g DPPH溶于250 mL甲醇中得0.2 mmol/L DPPH溶液，吸取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL樣液定容至2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液避光反應30 min，于波長517 nm處測定A517/i，同時測定2 mL待測液與2 mL溶劑無水乙醇混合后的吸光度值A517/j，以及2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度值A0。按式（1）計算DPPH自由基清除率。

②ABTS+自由基清除率測定：參照王子涵等[20]的測定方法略作改動，ABTS+自由基儲備液：準確量取440 mL濃度140 mmol/L過硫酸鉀溶液，加入25 mL濃度7 mmol/L的ABTS+溶液中混合，避光反應12～16 h，避光保存。測定前用無水乙醇將ABTS+自由基儲備液稀釋到OD734nm值為0.700±0.002，稀釋液當天用。

吸取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL樣液定容至2 mL，待測液混勻，吸取2.0 mL ABTS+自由基稀釋液，室溫下避光反應30 min，以無水乙醇為參比，于波長734 nm處測定吸光度值A1。以0.3 mL無水乙醇代替待測液作空白對照，測定吸光度值A0。VC作為陽性對照，ABTS+清除率按式（2）計算。

1.3.5 感官評定

分別選擇男女專家共10人，組成品評組，感官評分參考GB/T 15038—2006《葡萄酒與果酒》評分標準，見表2。

表2 枳椇山楂果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010整合試驗數(shù)據(jù)，每組試驗重復3次；使用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，利用方差分析（analysis of variance，ANOVA）與Duncan檢驗進行差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著；使用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 枳椇山楂果酒釀造工藝優(yōu)化

2.1.1 枳椇果汁與山楂果汁體積比對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響

單一的枳椇果汁發(fā)酵酒，酒體淡薄，香氣不足，不同枳椇果汁與山楂果汁體積比對果酒發(fā)酵效果的影響見表3。

表3 原料體積比對枳椇山楂酒發(fā)酵的影響Table 3 Effect of raw material volume ratio on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

由表3可知，添加外源山楂汁具有增加枳椇汁酸性的作用，直接表現(xiàn)為隨著山楂汁體積占比增加，復合汁pH下降；在相同發(fā)酵條件下，山楂汁占比增加可溶性固形物、殘?zhí)巧?，其原因是山楂汁的高酸性，酸度的降低對酵母的發(fā)酵能力存在一定的抑制作用[21]，而使得山楂汁體積占比高的混合果酒起發(fā)酵時間延后，其可溶性固形物、殘?zhí)堑淖兓@著趨勢與路遙[22]研究無花果的結果保持一致；在增加山楂汁體積占比大于40∶100之后酒精度降低，殘?zhí)巧?，酒體甜度高。山楂是一種極具營養(yǎng)價值的物質，含有豐富的黃酮類物質[23]，它的添加使得酒質中總酚、總黃酮含量呈現(xiàn)正相關性增長，但體積比超過60∶100后酒質中總酚增長不顯著（P＞0.05），說明其有效成分溶解達到飽和。綜合比較分析，枳椇果汁與山楂果汁體積比為40∶100與60∶100時，糖酸比協(xié)調，口感醇厚，稍有回味，有效活性成分及感官評分均最高。

2.1.2 不同初始糖含量對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響

考察不同初始糖含量對果酒的影響，結果見表4。由表4可知，在16%～24%初始糖度區(qū)間內，隨著初始糖度的增加，果酒酒精度隨之增加，符合果酒發(fā)酵特點[24]，但由于糖的高滲作用，高糖度又會對酵母菌生長產(chǎn)生抑制作用[21]，表現(xiàn)為初始糖度＞20%時，殘?zhí)羌翱扇苄怨绦挝锖吭黾樱沟霉浦械奶鸲妊谏w酒中的酸感、酒感，感官品質下降；總酚含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這與楊華等[25]發(fā)酵的趨勢相同；初始糖度在20%時，果酒清木香明顯、果香濃郁，糖酸比合適，回味悠長，表現(xiàn)出的感官評分最高為（72.15±1.25）分、總酚含量最高為（218.30±0.63）mg/100 mL。因而最佳初始糖度為20%。

表4 不同初始糖度對枳椇山楂果酒發(fā)酵的影響Table 4 Effect of different initial sugar content on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

2.1.3 不同酵母接種量對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響

酵母菌接種量影響果酒的發(fā)酵速率，發(fā)酵前期迅速發(fā)展成優(yōu)勢菌株對雜菌具有一定的抑制作用，一般酵母用量過低時，物料發(fā)酵不完全，造成發(fā)酵液酒精度偏低及酒香不明顯等現(xiàn)象，但發(fā)酵速率較快，產(chǎn)酸量增加會對果酒后期發(fā)酵過程產(chǎn)生影響，加速酵母菌的衰亡，同時酵母菌體自溶會使整個果酒酒體出現(xiàn)苦味[26]。不同酵母接種量對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響見表5。由表5可知，隨著接種量的逐步增大，殘?zhí)呛恐饾u降低，酒精度在接種量2%時最大，繼續(xù)增加酵母菌接種量酒精度上升趨勢減小，這與李慧蕓等[27]的研究一致；接種量對pH影響不顯著（P＞0.05）；總黃酮含量在酵母接種量1%與2%時表現(xiàn)為最大且二者差異不顯著（P＞0.05）。綜上可得，酵母接種量為2%時，總酚、總黃酮、總酸含量最高，所釀果酒酒香舒適，酸甜可口，口感醇厚，香氣清爽，其感官評分為（72.05±1.03）分。所以最佳酵母接種量為2%。

表5 不同酵母接種量對枳椇山楂果酒發(fā)酵的影響Table 5 Effect of different yeast inoculums on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵溫度對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響見表6。由表6可知，隨發(fā)酵溫度升高，酒精度呈現(xiàn)先增高后減小的趨勢，殘?zhí)桥c可溶性固形物表現(xiàn)出相反趨勢，符合果酒發(fā)酵趨勢，酒精度增高后下降的趨勢的原因是隨著發(fā)酵溫度的增加，酵母生長旺盛，營養(yǎng)物質如糖分主要用于自身生長繁殖，而用于分解產(chǎn)生乙醇的量減少，其變化趨勢與顧凡等[28]研究不同溫度對葡萄百香果酒結果一致；發(fā)酵溫度對總酚影響差異性顯著（P＜0.05），不同發(fā)酵溫度對殘?zhí)堑挠绊懕憩F(xiàn)為先降低后升高且差異性顯著（P＜0.05），在24 ℃的發(fā)酵溫度下殘?zhí)亲畹?。發(fā)酵溫度20～28 ℃時酒體中總酸含量較高；總黃酮含量隨發(fā)酵溫度升高而逐漸降低，24 ℃、28 ℃、32 ℃之間差異性不顯著（P＞0.05）。說明發(fā)酵溫度對酒體理化性質存在影響，在24 ℃殘?zhí)亲畹蚚（13.36±0.12）g/L]、總酸含量適中[（10.82±0.03）g/L]、感官評分（73.91±0.51）最優(yōu)，所以最佳發(fā)酵溫度為24 ℃。

表6 不同發(fā)酵溫度對枳椇山楂果酒發(fā)酵的影響Table 6 Effects of different fermentation temperature on fermentation of Hovenia dulcis and hawthorn fruit wine

2.1.5 不同發(fā)酵時間對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵時間對枳椇山楂果酒發(fā)酵效果的影響見表7。由表7可知，發(fā)酵時間對酒體pH的影響不顯著（P＞0.05），都維持在4.0左右；可溶性固形物隨發(fā)酵時間的延長而降低；不同發(fā)酵天數(shù)的酒精度存在顯著性差異（P＜0.05），酒精度總體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；殘?zhí)请S發(fā)酵時間的延長而降低，發(fā)酵7 d與其他時間的殘?zhí)呛看嬖诓町愶@著性（P＜0.05），9 d、11 d、13 d差異不顯著（P＞0.05），說明發(fā)酵在9 d后糖的利用達到最大，酵母菌死亡?？偹嶙兓?guī)律性不強，這可能與微生物代謝特性及生長曲線有關[29]；酚類物質為熱敏性物質，所以發(fā)酵時間越長酚類物質損失越嚴重，總酚含量呈現(xiàn)顯著性下降。發(fā)酵時間9 d時，酒精度較高[（11.45±0.15）%vol]、殘?zhí)禽^低[（14.55±0.25）g/L]，其感官評分（75.50±2.10）最高，所以正交試驗選擇發(fā)酵時間為9 d。

表7 不同發(fā)酵時間對枳椇山楂酒發(fā)酵的影響Table 7 Effect of different fermentation time on fermentation of Hovenia dulcis fruit wine

2.2 枳椇山楂果酒釀造工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析

以果酒的總酸含量、總酚含量及感官評分作為評價指標進行正交試驗優(yōu)化，試驗結果與分析見表8。由表8可知，當以總酸含量做評價指標時，對試驗結果影響次序為原料體積比＞初始糖度＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，最優(yōu)的釀造工藝為A3B3C1D2與A3B3C3D2，但由表9可知，總酸方差分析中發(fā)酵時間（C）影響差異不顯著（P＞0.05），總酸含量為指標的最優(yōu)工藝選擇A3B3C1D2即可；當以總酚含量做評價指標時，影響次序為初始糖度＞原料體積比＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，最優(yōu)的釀造工藝為A3B3C2D1；當以感官評價做評價指標時，影響次序為原料體積比＞發(fā)酵溫度＞初始糖度＞發(fā)酵時間，最優(yōu)的釀造工藝為A3B3C3D3。

表8 枳椇山楂果酒工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for Hovenia dulcis and hawthorn wine fermentation process optimization

分別以總酸、總酚、感官評分為響應值，采用方差分析考察各因素對正交試驗結果的影響，結果分別見表9～11。

由表9～表11可知，復配體積比對發(fā)酵果酒的總酸含量、感官評分有顯著性的影響（P＜0.05），初始糖度對發(fā)酵果酒的總酚含量有顯著性的影響（P＜0.05）；而發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度對總酸含量、總酚含量及感官評分的影響不顯著（P＞0.05）。

表9 以總酸含量為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests result with total acid content as evaluation index

表10 以總酚含量為評價指標正交試驗結果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal tests with total phenol content as evaluation index

表11 以感官評分為評價指標正交試驗結果方差分析Table 11 Analysis of variance of orthogonal tests result with sensory score as evaluation index

2.3 驗證試驗

根據(jù)正交試驗結果，以直觀分析感官評分最高的試驗8號A3B2C1D3為參照，根據(jù)總酸、總酚、感官評分為評價指標優(yōu)選出的工藝組合A3B3C1D2、A3B3C2D1和A3B3C3D3進行驗證，結果見表12。由表12可知，A3B3C3D3工藝的總酚含量（270.59±2.00）mg/100 mL、感官評分（81.34±2.10）分最高，選擇其為最適發(fā)酵工藝，即體積比60∶100、初始糖度21.0%、發(fā)酵時間10 d、發(fā)酵溫度25 ℃。在此條件下復合果酒酒液澄清透亮，酒體顏色呈現(xiàn)金黃，無懸浮沉淀，酒香濃郁，酒體豐厚但口感稍酸，回味悠長，酒精度為11.34%vol，總酸為14.40 g/L，總酚為270.59 mg/100 mL，感官評分為81.34分。

表12 最佳工藝驗證結果Table 12 Validation tests results of the optimal process

2.4 枳椇山楂果酒抗氧化能力

果酒及VC對DPPH自由基及ABTS+自由基清除能力的測定結果見圖1。由圖1A可知，稀釋10倍枳椇山楂酒的DPPH自由基清除能力高于0.3%VC和枳椇果酒，表現(xiàn)出較高的DPPH自由基清除能力，其研究結果與唐蘭芳等[30]枳椇發(fā)酵酒DPPH自由基清除率曲線相一致；在樣品量為0.4 mL時DPPH自由基清除率分別為（89.92±0.06）%、（95.27±0.05）%、（91.57±0.12）%，且三者存在顯著性差異（P＜0.05）；其中枳椇山楂果酒與枳椇果酒較0.3%VC的DPPH自由基清除能力較優(yōu)。

由圖1B可知，稀釋10倍的枳椇山楂果酒表現(xiàn)出更高的ABTS+自由基清除率，稀釋10倍的枳椇山楂果酒在用量0.28 mL前清除率高于0.3%VC液和枳椇果酒，用量在0.28 mL之后，0.3%VC液高于稀釋10倍的枳椇山楂果酒和枳椇果酒；在樣品量0.30 mL其ABTS+自由基清除率分別是（92.86±0.14）%、（96.79±0.36）%以及（74.07±0.36）。之后隨著樣品量的增加，添加山楂汁發(fā)酵的枳椇山楂果酒的ABTS+自由基清除能力也始終高于枳椇果酒。

圖1 不同樣品DPPH自由基（A）及ABTS+（B）清除能力比較Fig.1 Comparison of scavenging ability of DPPH free radical (A) and ABTS+(B) of different samples

3 結論

本研究運用單因素試驗結合正交試驗設計的基礎上分析得出了枳椇山楂果酒釀造的最優(yōu)工藝參數(shù)：復配比例60∶100、初始糖度21%、發(fā)酵溫度25 ℃、發(fā)酵時間9 d，此條件下得到的枳椇山楂果酒酒香濃郁、伴隨青木香、入口稍酸、顏色金黃，酒精度為11.34%vol、總酸含量為14.69 g/L、總酚含量為280.59 mg/100 mL、感官分值為81.34。稀釋10倍枳椇山楂復合果酒其DPPH自由基與ABTS+自由基清除能力均優(yōu)于枳椇果酒。