小米中4種蛋白的分級(jí)提取及結(jié)構(gòu)表征

侯超凡， 陳振家， 郝利平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，太谷 030801)

小米又稱栗米，是我國(guó)北方廣泛種植的作物之一，由谷子脫殼而成[1]。小米所含的各種營(yíng)養(yǎng)素豐富，口感良好，深受北方人的喜愛(ài)[2]。小米中營(yíng)養(yǎng)素比例比較均衡，是一種良好的飲食來(lái)源。相較于其他常見(jiàn)的谷物，小米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更優(yōu)，與水稻、玉米等谷物相比，小米的蛋白質(zhì)含量更高[3]；與大米和小麥等谷物相比，小米中所含的鈣、膳食纖維也更多[4]。同時(shí)，小米蛋白也是優(yōu)質(zhì)蛋白的來(lái)源，其消化率高達(dá)83.4%，可用于食品調(diào)味品、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、食品添加劑等多個(gè)領(lǐng)域中[5]。

小米中含有豐富的蛋白質(zhì)，其蛋白具有低過(guò)敏性的特點(diǎn)[6]。小米蛋白質(zhì)的氨基酸組成模式中賴氨酸和蘇氨酸是限制性氨基酸，但其必需氨基酸的含量高于稻米和小麥[7]。小米蛋白質(zhì)根據(jù)溶解特性分為4種蛋白，水溶性的清蛋白，鹽溶性的球蛋白，醇溶性的醇溶蛋白以及堿溶性的谷蛋白[8]。大多數(shù)谷物蛋白有一個(gè)共同特點(diǎn)：谷物蛋白中清蛋白和球蛋白的含量極少，醇溶蛋白和谷蛋白含量較高。魏益民等[9]用Osborne分級(jí)提取法提取小米蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醇溶蛋白和谷蛋白分別占46.0%和21.2%，清蛋白和球蛋白共占5.5%。與玉米醇溶蛋白相似，小米醇溶蛋白表面疏水性高，難溶于水，易溶于醇[10，11]。姬中偉[7]對(duì)小米醇溶蛋白進(jìn)行改性酶解制備了具有抗氧化活性的小米醇溶蛋白肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解小米醇溶蛋白肽在小鼠體內(nèi)具有抗氧化和抗炎活性。目前小米蛋白的提取方法主要為堿提酸沉法[12]和Osborne分級(jí)提取法，楊樺等[13]發(fā)現(xiàn)超聲波輔助酶法有助于提取蛋白。然而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于小米蛋白完整的結(jié)構(gòu)表征報(bào)道較少。

采用Osborne分級(jí)提取法提取小米4種蛋白，對(duì)4種蛋白的微觀形態(tài)，亞基分子質(zhì)量分布，粒徑和Zeta-電位，二級(jí)結(jié)構(gòu)，紫外光譜、熒光光譜以及表面疏水性進(jìn)行結(jié)構(gòu)方面的研究，為小米蛋白產(chǎn)品的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晉谷21號(hào)小米購(gòu)于山西晉中；PBS緩沖液；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒；考馬斯亮藍(lán)G250；5x非還原型蛋白上樣緩沖液；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHIA-10A-50A冷凍干燥機(jī)；Nicolet iS10傅里葉紅外(FT-IR)光譜儀；JSM-7500F冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡；YS-04A小型高速粉碎機(jī)；KDC-1044L大容量低速離心機(jī)；HC-2064高速離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將小米粉碎、過(guò)篩，用石油醚對(duì)小米粉進(jìn)行脫脂，干燥后采用Osborne分級(jí)提取法[14]分級(jí)提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白使用蒸餾水(料液比1∶10)進(jìn)行提取，球蛋白使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氯化鈉溶液(料液比1∶10)進(jìn)行提取，醇溶蛋白使用80%乙醇溶液(料液比1∶10)進(jìn)行提取，谷蛋白使用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液(料液比1∶10)進(jìn)行提取，提取出的蛋白進(jìn)行透析除鹽。

1.3.2 掃描電鏡觀察

使用冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡[15]對(duì)小米4種蛋白進(jìn)行微觀形態(tài)觀察，加速電壓為5 kV，觀察倍數(shù)為1 000～30 000，使用配套軟件進(jìn)行捕捉圖像。

1.3.3 SDS-PAGE分析

參考Laemmli[16]的SDS-PAGE法對(duì)小米4種蛋白進(jìn)行分析，將蛋白樣品溶解于還原型上樣緩沖液中，振蕩完全后置于沸水中充分反應(yīng)5 min，冷卻后離心備用。電泳膠采用12%的分離膠和5%的濃縮膠制得，在電泳槽位依次加入5 μL的Maker蛋白標(biāo)樣以及20 μL的蛋白上樣緩沖液。濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V，條帶距底部1 cm處電泳停止。將電泳膠進(jìn)行染色及脫色后掃描成圖分析。

1.3.4 粒徑分布、平均粒徑及Zeta電位測(cè)定

通過(guò)電位分析儀對(duì)小米4種蛋白組分懸浮粒徑進(jìn)行測(cè)定，清蛋白、球蛋白及谷蛋白用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋至1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀釋至1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定三次結(jié)果取平均值，采用相同方法進(jìn)行Zeta-電位測(cè)定[17]。

1.3.5 傅里葉紅外光譜測(cè)定

利用傅里葉紅外光譜儀對(duì)小米4種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定[18]，將凍干樣品和溴化鉀研磨均勻后壓片置于光譜儀中進(jìn)行分析，記錄樣品在400～4 000 cm-1透過(guò)率的變化。

1.3.6 紫外光譜測(cè)定

通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量小米4種蛋白溶液的紫外光譜[19]，掃描波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，掃描速度為300 nm/min，數(shù)據(jù)間隔為0.5 nm。清蛋白、清蛋白、谷蛋白使用PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋到1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀釋至1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定[20]，每個(gè)測(cè)定做三組平行結(jié)果取平均值。

1.3.7 熒光光譜測(cè)定

使用熒光光度計(jì)測(cè)量小米4種蛋白溶液的熒光光譜[21]，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，狹縫寬度為3 nm，掃描波長(zhǎng)范圍為290～430 nm。清蛋白、清蛋白、谷蛋白使用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋到1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定，醇溶蛋白用70%乙醇溶液稀釋至1 mg/mL進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)測(cè)定做三組平行取平均值。

1.3.8 表面疏水性測(cè)定

通過(guò)ANS熒光探針?lè)╗22]測(cè)定小米4種蛋白的表面疏水性。使用0.02 mol/L的PBS緩沖液(pH 7.4)將4種蛋白分別稀釋至0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL，將4 mL的蛋白稀釋液與20 μL的ANS溶液(8 mmol/L)混合振蕩后避光反應(yīng)，15 min后放于熒光光度計(jì)中測(cè)定熒光強(qiáng)度。將蛋白質(zhì)量濃度(mg/mL)與測(cè)得的熒光強(qiáng)度作圖，經(jīng)過(guò)線性回歸擬合后求得斜率作為4種蛋白的表面疏水性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，并使用Origin 9.1、PeakFitv4.12、GraphPad Prism 8軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米4種蛋白微觀形態(tài)

使用掃描電鏡對(duì)小米4種蛋白的微觀形態(tài)進(jìn)行了觀察。圖1a中清蛋白的直徑在200 nm左右，清蛋白顆粒之間呈現(xiàn)不同程度的融合和折疊；圖1b中球蛋白的直徑在100～500 nm之間，蛋白之間形成了簇狀結(jié)構(gòu)，發(fā)生了一定程度的拉伸與融合，形狀多樣，有呈塊狀的趨勢(shì)；圖1c中醇溶蛋白的直徑在50～500 nm之間，顆粒分明，聚集程度小，但堆積程度高；圖1d中谷蛋白的直徑在200～1 100 nm之間，蛋白大小不一，沒(méi)有發(fā)生聚集，但都堆積在一起。Gulati等[23]在黍米粉和提取的蛋白質(zhì)中觀察到球形蛋白體，以簇狀形態(tài)存在，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖1 小米4種蛋白的微觀形態(tài)

2.2 小米4種蛋白的亞基分布

小米4種蛋白的亞基分布如圖2所示。清蛋白的分子質(zhì)量分布在11～180 ku之間，亞基條帶分布廣，無(wú)特征亞基條帶出現(xiàn)；球蛋白的分子質(zhì)量分布在11～75 ku之間，亞基條帶主要集中在11～19 ku，球蛋白有兩條明顯的特征亞基條帶出現(xiàn)，分子質(zhì)量分別為18 ku和66 ku；醇溶蛋白的分子質(zhì)量分布在11～22 ku之間，條帶分布清晰，有三條明顯的特征亞基條帶，其分子質(zhì)量分別為12、18、22 ku，醇溶蛋白的這三條亞基帶分別名為α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白，這與郭蓮東[24]等的研究相似；谷蛋白的分子質(zhì)量分布在17～180 ku之間，谷蛋白有4條明顯的特征亞基條帶，其分子質(zhì)量分別為18、22、95、180 ku。除了球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白具有特征亞基帶外，小米4種蛋白含有一些分子質(zhì)量相同的亞基帶。

圖2 小米4種蛋白的亞基分布

2.3 小米4種蛋白粒徑分布、平均粒徑和Zeta-電位分析

通過(guò)電位分析儀的動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)定了4種蛋白懸浮液的粒徑分布、平均粒徑以及Zeta-電位。從圖3可見(jiàn)，懸浮液中的清蛋白粒徑分布在50～950 nm之間，粒徑為295 nm的清蛋白聚集體強(qiáng)度最高；球蛋白粒徑分布在150～600 nm之間，粒徑為220 nm的球蛋白聚集體強(qiáng)度最高；醇溶蛋白粒徑分布在0～300 nm之間，粒徑為24.4 nm和142 nm處的醇溶蛋白聚集體強(qiáng)度較高；谷蛋白粒徑分布在0～600 nm之間，粒徑為164 nm處的谷蛋白聚集體強(qiáng)度最高，4種蛋白中球蛋白分布最緊湊，粒徑強(qiáng)度也更高。

圖3 小米4種蛋白的粒徑分布

平均粒徑可以反映蛋白顆粒群體的平均尺度。從圖4可見(jiàn)，清蛋白聚集體的平均粒徑為215 nm，球蛋白聚集體的平均粒徑為225 nm，醇溶蛋白聚集體的平均粒徑為162 nm，谷蛋白聚集體的平均粒徑為144 nm，4種蛋白中球蛋白的平均粒徑最大。平均粒徑結(jié)果表明清蛋白和球蛋白的分子粒徑較大，這可能與清蛋白和球蛋白的簇狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，聚集程度高，這與掃描電鏡中對(duì)其表觀形貌的觀察結(jié)果相一致。

圖4 小米4種蛋白的平均粒徑

由于蛋白納米顆粒會(huì)帶有電荷，電荷會(huì)影響周?chē)鷳腋∫旱碾x子分布，顆粒周?chē)幕瑒?dòng)層為Zeta-電位，所以Zeta-電位的絕對(duì)值大小可以反應(yīng)懸浮液的穩(wěn)定性[25]。Zeta-電位的絕對(duì)值小于30 mV表示懸浮液不穩(wěn)定，相反Zeta-電位的絕對(duì)值大于30 mV表示懸浮液體系穩(wěn)定。由圖5可見(jiàn)，清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的Zeta-電位分別為-11.63 mV、19.77 mV和-7.94 mV，這三種蛋白Zeta-電位的絕對(duì)值都小于30mV，說(shuō)明三種蛋白懸浮液穩(wěn)定性差，更容易產(chǎn)生沉淀，谷蛋白的Zeta-電位為-34.97 mV，其絕對(duì)值大于30 mV，這表明谷蛋白的懸浮液穩(wěn)定性很好，保存時(shí)間更長(zhǎng)。

圖5 小米4種蛋白的Zeta-電位

2.4 小米4種蛋白紅外結(jié)構(gòu)分析

圖6 小米4種蛋白的紅外光譜

從表1中可以看到4種蛋白中都含有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、β-反平行折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。其中α-螺旋、β-折疊以及β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量較高，β-反平行折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量較低。特別地，與其他三種蛋白相比醇溶蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量明顯較低。

2.5 紫外光譜分析

蛋白中由于含有一些發(fā)色基團(tuán)(羰基、羧基等)，這些發(fā)色基團(tuán)可以吸收部分波長(zhǎng)的紫外光而使得蛋白具有紫外吸收光譜，發(fā)色基團(tuán)不同，蛋白的吸收峰位置也不同[27]。從圖7中可以清晰看到4種蛋白分別含有兩個(gè)特征吸收峰，清蛋白和球蛋白在210 nm處有特征吸收峰，醇溶蛋白和谷蛋白在225 nm處有特征吸收峰；220 nm附近吸收峰的形成主要是由于蛋白中的肽鍵所引起的，還可以看到球蛋白在260 nm處有較強(qiáng)的特征吸收峰，此吸收峰的形成可能跟苯丙氨酸殘基發(fā)光有關(guān)，這表明球蛋白內(nèi)苯丙氨酸在微環(huán)境中表達(dá)程度較高，清蛋白和谷蛋白在275 nm處有微弱的特征吸收峰，醇溶蛋白在280 nm處有較強(qiáng)的特征吸收峰，280 nm附近吸收峰的形成是由于色氨酸殘基和酪氨酸殘基內(nèi)的共軛雙鍵引起的，說(shuō)明這三種蛋白中酪氨酸、色氨酸的表達(dá)程度高。

表1 小米4種蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量

圖7 小米4種蛋白的紫外光譜

2.6 熒光光譜分析

與紫外光譜相似，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的氨基酸殘基在紫外光的激發(fā)下會(huì)發(fā)射熒光，因此熒光光譜檢測(cè)是對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)表征的常用手段[28]。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)表達(dá)熒光的氨基酸有色氨酸和賴氨酸，色氨酸的熒光強(qiáng)度更高，因此以檢測(cè)色氨酸為主的熒光強(qiáng)度可以反映4種蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。由圖8可知，在固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm的條件下，清蛋白在349 nm處熒光強(qiáng)度最高，球蛋白在348 nm處熒光強(qiáng)度最高，醇溶蛋白在341 nm處熒光強(qiáng)度最高，谷蛋白在342 nm處熒光強(qiáng)度最高。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以初步判斷，4種蛋白中色氨酸與酪氨酸總量：清蛋白>醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白。

圖8 小米4種蛋白的熒光光譜

2.7 小米4種蛋白的表面疏水性

蛋白質(zhì)的表面疏水性與其在水中的溶解度有關(guān)，溶解度越高，表面疏水性越低[29]。疏水性氨基酸越多，越可以改善水和蛋白質(zhì)的相互作用，從而達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的效用。此外蛋白質(zhì)的起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性以及乳化穩(wěn)定性都與表面疏水性有關(guān)。從圖9可以看出，疏水性：醇溶蛋白>球蛋白>谷蛋白>清蛋白。參考Osbrone分級(jí)提取法的原理，清蛋白是由蒸餾水提取出來(lái)的，說(shuō)明清蛋白更能溶于水，結(jié)果也顯示清蛋白的疏水性最低，醇溶蛋白由醇類試劑提取，在水中的溶解度不強(qiáng)，所以醇溶蛋白的表面疏水性最高，鹽提的球蛋白和堿提的谷蛋白疏水性介于中間。

圖9 小米4種蛋白的表面疏水性

3 結(jié)論

通過(guò)SDS-PAGE、掃描電鏡、粒徑、Zeta-電位、FTIR、紫外光譜、熒光光譜、表面疏水性對(duì)小米4種蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征?？梢园l(fā)現(xiàn)微觀狀態(tài)下的清蛋白和球蛋白存在簇狀結(jié)構(gòu)，有呈塊狀的趨勢(shì)，粒徑分析也表明清球蛋白平均粒徑較大，醇溶蛋白和谷蛋白堆積程度高，但蛋白顆粒分明，不聚集。從電泳圖中觀察到醇溶蛋白亞基分子質(zhì)量低(11～25 ku)，亞基帶分布明顯清晰，而小分子蛋白更容易被人體消化吸收，清蛋白、球蛋白、谷蛋白亞基帶分布廣泛。醇溶蛋白Zeta-電位最低，在介質(zhì)中最不穩(wěn)定，更容易產(chǎn)生沉淀，谷蛋白的Zeta-電位絕對(duì)值超過(guò)30 mV，說(shuō)明其在介質(zhì)中最穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)。二級(jí)結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)4種蛋白中各個(gè)結(jié)構(gòu)都有占比，在有序結(jié)構(gòu)中，清蛋白的α-螺旋和β-折疊所占比例最高(55.18%)，其次是谷蛋白(54.80%)和球蛋白(52.93%)，而醇溶蛋白的有序結(jié)構(gòu)占比最低(43.75%)。紫外光譜和熒光光譜顯示4種蛋白在紫外光的照射下均出現(xiàn)不同波長(zhǎng)特征吸收峰，這與其內(nèi)含氨基酸殘基有關(guān)。清蛋白表面疏水性最低，溶解性更好，醇溶蛋白與之相反，而溶解性又與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)如起泡性、起泡穩(wěn)定性等有關(guān)，因而，醇溶蛋白的功能性質(zhì)較差，不利于加工，利用率低，之后研究可利用一些方法對(duì)醇溶蛋白進(jìn)行改性，從而改善其功能性質(zhì)。