DNA質(zhì)量濃度測(cè)定在煙絲加工均質(zhì)化中的應(yīng)用研究

王光耀，王仰勛，何聲寶，白國(guó)強(qiáng)，張威，王英元，張曉慧，劉楠

1.江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 南京卷煙廠，江蘇 南京 210012；2.國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南 鄭州 450001

0 引言

近年來(lái)，隨著我國(guó)煙草特色工藝技術(shù)的推廣和發(fā)展，煙草行業(yè)對(duì)卷煙生產(chǎn)過(guò)程中的精細(xì)化程度及卷煙產(chǎn)品的穩(wěn)定性、一致性要求越來(lái)越高[1-2]，消費(fèi)者對(duì)卷煙產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的要求也伴隨卷煙產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)升級(jí)不斷提高[3-4]。新的形勢(shì)對(duì)卷煙工業(yè)企業(yè)的生產(chǎn)加工提出了新的要求，企業(yè)要獲得更好的發(fā)展，勢(shì)必要對(duì)卷煙生產(chǎn)的均質(zhì)化進(jìn)行深入研究[5]。均質(zhì)化是指同一批次或不同批次的產(chǎn)品品質(zhì)一致，不同生產(chǎn)點(diǎn)生產(chǎn)的同規(guī)格產(chǎn)品品質(zhì)一致[6]。

卷煙生產(chǎn)的均質(zhì)化研究涉及很多方面，而制絲線煙絲摻配、加工均勻性是其中較為重要的研究?jī)?nèi)容，直接關(guān)系到卷煙產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和一致性[7]。煙絲摻配、加工的均質(zhì)化檢驗(yàn)，是塑造卷煙產(chǎn)品風(fēng)格特征、保障卷煙產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性的必要環(huán)節(jié)[8]，目前的檢驗(yàn)手段主要是人員現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督、成品評(píng)吸檢驗(yàn)和成品化學(xué)檢驗(yàn)，存在一定局限性：人員現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)督一般是按照產(chǎn)品工藝要求對(duì)某個(gè)加工過(guò)程進(jìn)行監(jiān)督，很難實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)加工的全程監(jiān)督；評(píng)吸檢驗(yàn)是主觀性檢驗(yàn)技術(shù)，雖然檢驗(yàn)人員可以大體確定不同批次樣品總體風(fēng)格特征的差異，但很難客觀、準(zhǔn)確地反映原料均質(zhì)化程度和工藝參數(shù)設(shè)置的合理性；化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)是評(píng)吸檢驗(yàn)技術(shù)的補(bǔ)充，雖然一定程度上能夠反映原料摻配的均勻程度，但是也存在時(shí)效性差且不能為工藝參數(shù)設(shè)置提供參考的問題；基于化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的紅外檢驗(yàn)技術(shù)，同樣不能為工藝參數(shù)設(shè)置提供參考，且其檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性還有待提高[9]。

因此，尋找合適的檢測(cè)指標(biāo)或技術(shù)手段，既能對(duì)煙絲摻配和加工均勻性進(jìn)行判斷，又能對(duì)工藝參數(shù)的不正常波動(dòng)進(jìn)行預(yù)警，對(duì)卷煙生產(chǎn)的均質(zhì)化有重要意義。煙草DNA存在于天然原料中，對(duì)于原料摻比、工藝參數(shù)的變化都較為敏感[10-11]，原料在制絲線各個(gè)工藝環(huán)節(jié)中DNA質(zhì)量濃度的變化，可以客觀反映其均質(zhì)化程度，DNA質(zhì)量濃度測(cè)定技術(shù)在原料均質(zhì)化檢驗(yàn)領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。鑒于此，本文擬以常規(guī)化學(xué)成分檢測(cè)和感官評(píng)吸評(píng)價(jià)樣品的均勻性，然后測(cè)定不同品種、不同重復(fù)煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度，以分析DNA質(zhì)量濃度測(cè)定用于煙絲加工均質(zhì)化檢測(cè)的合理性，設(shè)定并驗(yàn)證煙絲DNA質(zhì)量濃度的合理波動(dòng)范圍，以期為煙絲加工均質(zhì)化的檢測(cè)提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：氯仿(三氯甲烷)、西曲溴銨(CTAB)、乙醇、苯酚，均為色譜純，德國(guó)默克公司產(chǎn)。

主要儀器：Nano-300型超微量分光光度計(jì)，杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)；AA3型連續(xù)流動(dòng)分析儀，英國(guó)Seal公司產(chǎn)；FP240型烘箱，德國(guó)Binder公司產(chǎn)。

1.2 取樣方法

在南京卷煙廠某規(guī)格卷煙的制絲線進(jìn)行取樣，取樣點(diǎn)設(shè)在貯絲柜之后的傳送帶上，煙絲經(jīng)過(guò)該取樣點(diǎn)之后，被風(fēng)力傳送至卷接車間。取樣人員佩戴一次性手套，隨機(jī)抓取5把煙絲，其質(zhì)量之和不小于1 kg，將煙絲放在一次性塑料布(2塊，1 m×1 m)上，現(xiàn)場(chǎng)按4分法進(jìn)行混勻，混勻后按5點(diǎn)取樣法抽取樣品約50 g(每個(gè)取樣點(diǎn)約10 g)，裝入可密封的樣品袋內(nèi)，其余煙絲放回制絲線傳送帶。在取樣點(diǎn)隨機(jī)進(jìn)行10次取樣(樣品編號(hào)s1—s10)，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

在與s1—s10同規(guī)格同配方卷煙制絲線取樣點(diǎn)隨機(jī)進(jìn)行3次取樣(樣品編號(hào)y1—y3)，在與s1—s10不同規(guī)格不同配方卷煙制絲線取樣點(diǎn)也隨機(jī)進(jìn)行3次取樣(樣品編號(hào)b1—b3)，隨后將樣品袋密封好，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。另外，以南京卷煙廠卷煙生產(chǎn)常用的5個(gè)品種片煙的煙絲樣品(樣品編號(hào)p1—p5)做對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.3 樣品均勻性評(píng)價(jià)方法

1)常規(guī)化學(xué)成分檢測(cè)方法

按照相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定[12-17]，對(duì)煙絲樣品進(jìn)行常規(guī)化學(xué)成分糖、總氮、總植物堿、氯、鉀和水分檢測(cè)，以各指標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差和《打葉煙葉 烤煙質(zhì)量均勻性評(píng)價(jià)》(YC/T 366—2010)[18]所測(cè)定的糖堿比評(píng)價(jià)樣品的均勻性。

2)感官評(píng)吸方法

將抽取的煙絲制成卷煙，依照《卷煙 第4部分：感官技術(shù)要求》(GB 5606.4—2005 )[19]和《煙草及煙草制品 感官評(píng)價(jià)方法》(YC/T 138—1998)[20]進(jìn)行評(píng)吸，以感官評(píng)吸結(jié)果來(lái)輔助評(píng)價(jià)樣品的均勻性。

1.4 DNA質(zhì)量濃度測(cè)定方法

為確定適宜的用于DNA質(zhì)量濃度測(cè)定的樣品質(zhì)量，進(jìn)行了8個(gè)質(zhì)量梯度(0.025 g，0.050 g，0.075 g，0.100 g，0.125 g，0.150 g，0.175 g和0.200 g)的DNA提取實(shí)驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量梯度進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，對(duì)比DNA提取效果以確定適宜的DNA提取樣品質(zhì)量。

所有樣品均在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行粉碎，過(guò)40目篩，并將過(guò)篩后的樣品反復(fù)混勻。樣品DNA提取過(guò)程如下：將適量樣品和液氮在研缽中研磨，而后移入2 mL離心管中；加入600～800 μL的CTAB提取緩沖液(CTAB于65 ℃水浴預(yù)熱)，混勻，每3～5 min輕輕振蕩幾次，20 min后12 000 r/min離心10～15 min；小心吸取上清液500 μL，在上清液中加入各400 μL的苯酚、氯仿溶液，混勻，于4 ℃，12 000 r/min條件下，離心10～15 min；吸取上清液350 μL，加入等體積的氯仿，混勻，于4 ℃，12 000 r/min條件下，離心10～15 min，重復(fù)2～3次，以不出現(xiàn)蛋白層為限；取上清液，-20 ℃沉淀1～2 h，于4 ℃，12 000 r/min條件下，離心10～15 min；棄去上清液，用50%～70%乙醇洗滌沉淀2次；室溫下干燥10～15 min后，于-20 ℃或-70 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

為保證DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品均進(jìn)行多次平行檢測(cè)。以超微量分光光度計(jì)進(jìn)行所抽取樣品的DNA質(zhì)量濃度測(cè)定，DNA的純度根據(jù)OD260/OD280比值判斷。

1.5 DNA質(zhì)量濃度測(cè)定用于煙絲加工均質(zhì)化檢測(cè)的合理性分析方法

以不同品種樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果進(jìn)行合理性分析，理論上摻配、加工情況一致性較好的煙絲其DNA質(zhì)量濃度應(yīng)該非常接近，因此可以嘗試?yán)脽熃zDNA質(zhì)量濃度來(lái)衡量煙絲摻配、加工的均勻性。以樣品p1—p5做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，每個(gè)品種進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，以DNA質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定DNA質(zhì)量濃度測(cè)定技術(shù)檢測(cè)煙絲樣品加工均質(zhì)化的合理性。

以不同重復(fù)樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果進(jìn)行合理性分析。對(duì)樣品s1—s10中提取的DNA質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品進(jìn)行8次平行測(cè)定，取其平均值作為樣品DNA質(zhì)量濃度。以DNA質(zhì)量濃度為指標(biāo)，確定DNA質(zhì)量濃度測(cè)定技術(shù)檢測(cè)樣品加工均質(zhì)化的合理性。

1.6 DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍確定及其有效性驗(yàn)證方法

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)95%置信區(qū)間的計(jì)算方法，以DNA質(zhì)量濃度平均值±2倍標(biāo)準(zhǔn)差,即(Sm±2SD)作為煙絲DNA質(zhì)量濃度的波動(dòng)范圍。

理論上，同規(guī)格同配方的卷煙因其具有同樣的煙絲摻配、加工工藝條件，其DNA質(zhì)量濃度應(yīng)該是接近的，而不同規(guī)格不同配方卷煙的DNA質(zhì)量濃度應(yīng)該具有較大差別。對(duì)樣品y1—y3和b1—b3的DNA質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè)，以DNA質(zhì)量濃度為指標(biāo)驗(yàn)證煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍的有效性。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品均勻性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.1.1 常規(guī)化學(xué)成分評(píng)價(jià)結(jié)果煙絲樣品s1—s10的常規(guī)化學(xué)成分檢測(cè)結(jié)果如表1所示。由表1計(jì)算可得，樣品s1—s10總氮、氯、堿、糖、鉀水分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差分別為2.01%、2.05%、1.39%、1.78%、3.37%、4.13%，糖堿比相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差也只有2.23%，達(dá)到a級(jí)(<8%)，說(shuō)明10次取樣的樣品均勻性、一致性較好，同時(shí)也說(shuō)明取樣時(shí)制絲線的工作狀態(tài)正常，在制絲線取到的樣品都是有效的，可以用來(lái)做進(jìn)一步的分析。

表1 煙絲樣品常規(guī)化學(xué)成分檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of routine chemical composition of cut tobacco samples

2.1.2 感官評(píng)吸評(píng)價(jià)結(jié)果以s1作為對(duì)照樣品，分別與s2—s10進(jìn)行對(duì)比評(píng)吸和三角評(píng)吸，對(duì)比評(píng)吸中所有樣品的得分范圍為89～91分 ，樣品得分差異在1分之內(nèi)，說(shuō)明所取樣品無(wú)顯著性差異；樣品的三角評(píng)吸結(jié)果表明所有樣品無(wú)差異，進(jìn)一步說(shuō)明了所取樣品的均勻性、一致性較好。

2.2 DNA質(zhì)量濃度測(cè)定方法條件優(yōu)化

不同質(zhì)量的煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果如表2所示。由表2可知，隨著樣品質(zhì)量的增加，DNA質(zhì)量濃度也逐步增加。樣品量太少，不易稱取，且影響結(jié)果的均勻性；樣品量過(guò)大，裂解不充分，將導(dǎo)致DNA質(zhì)量濃度下降，且樣品量過(guò)大，對(duì)DNA的純度也有一定影響。0.100 g樣品用于DNA質(zhì)量濃度測(cè)定與分析，質(zhì)量適中，比較容易稱取，且裂解完全，DNA純度和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性均較好。

表2 不同質(zhì)量的煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of DNA mass concentration of cut tobacco samples with different weights

2.3 DNA質(zhì)量濃度測(cè)定用于煙絲加工均質(zhì)化檢測(cè)的合理性分析結(jié)果

2.3.1 不同品種煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度分析結(jié)果不同品種煙絲樣品(樣品p1—p5)的DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果如表3所示。由表3可知，各品種間DNA質(zhì)量濃度差異較大，說(shuō)明如果卷煙生產(chǎn)中煙絲摻配比例發(fā)生變化，煙絲整體的DNA質(zhì)量濃度也會(huì)發(fā)生顯著變化，以煙絲DNA質(zhì)量濃度來(lái)衡量煙絲摻配的均勻性是合理的。

表3 不同品種煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of DNA mass concentration of cut tobacco samples of different varieties

2.3.2 不同重復(fù)煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度分析結(jié)果不同重復(fù)煙絲樣品(s1—s10)的DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果如表4所示。由表4可知，10個(gè)樣品的DNA質(zhì)量濃度分析結(jié)果均勻性、一致性較好，10個(gè)樣品的DNA質(zhì)量濃度SD為1.895 ng/μL，經(jīng)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差僅為2.06%，說(shuō)明可以用煙絲DNA質(zhì)量濃度來(lái)對(duì)煙絲樣品的均勻性進(jìn)行檢測(cè)。

表4 不同重復(fù)煙絲樣品的DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果Table 4 DNA mass concentration determination results of different repeated cut tobacco samples

2.4 DNA質(zhì)量濃度范圍確定及有效性驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)2.3.2中的檢測(cè)結(jié)果，借用統(tǒng)計(jì)學(xué)95%置信區(qū)間的計(jì)算方法，以(92.050±3.790) ng·μL-1作為煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍。樣品s1—s10在該煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍內(nèi)的位置如圖1所示。由圖1可知，均質(zhì)化較好的樣品s1—s10的DNA質(zhì)量濃度均在煙絲DNA質(zhì)量濃度的波動(dòng)范圍內(nèi)。

圖1 樣品s1—s10在煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍內(nèi)的位置示意圖Fig.1 Position diagram of sample s1—s10 within the fluctuation range of cut tobacco DNA mass concentration

樣品y1—y3和b1—b3在該煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍內(nèi)的位置如圖2所示。由圖2可知，樣品y1—y3與s1—s10同規(guī)格同配方，其DNA質(zhì)量濃度值均在設(shè)定波動(dòng)范圍內(nèi)，而b1—b3與s1—s10不同規(guī)格不同配方，其DNA質(zhì)量濃度值均在設(shè)定波動(dòng)范圍外，說(shuō)明本文設(shè)定的煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍是合理、有效的，可以應(yīng)用于制絲線煙絲加工均質(zhì)化的檢測(cè)。

圖2 樣品y1—y3和b1—b3在煙絲DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍內(nèi)的位置示意圖Fig.2 Position diagram of samples y1-y3 and b1-b3 within the fluctuation range of cut tobacco DNA mass concentration

3 結(jié)論

在南京卷煙廠某規(guī)格卷煙制絲線末端進(jìn)行取樣，以常規(guī)化學(xué)成分檢測(cè)和感官評(píng)吸結(jié)果對(duì)煙絲的均勻性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明:所有常規(guī)化學(xué)成分檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差最高只有4.13%，兩兩對(duì)比評(píng)吸打分結(jié)果偏差在1分以內(nèi)，說(shuō)明樣品均勻性、一致性滿足要求，可以用于DNA質(zhì)量濃度測(cè)定。不同品種煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果差異較大，不同重復(fù)煙絲樣品DNA質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差為2.06%，說(shuō)明以DNA質(zhì)量濃度為檢測(cè)指標(biāo)可以來(lái)衡量樣品均勻性。進(jìn)一步以(Sm±2SD)作為DNA質(zhì)量濃度合理波動(dòng)范圍，并以同規(guī)格同配方和不同規(guī)格不同配方的煙絲樣品對(duì)該范圍進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明以(Sm±2SD)作為DNA質(zhì)量濃度波動(dòng)范圍是合理有效的，可以對(duì)制絲線煙絲加工的均質(zhì)化進(jìn)行檢測(cè)。DNA質(zhì)量濃度測(cè)定技術(shù)在卷煙均質(zhì)化加工領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。