冬蟲夏草提取液有效成分分析及其在卷煙中的應(yīng)用研究

田數(shù)，柴穎，田大勇，董露，王非易，高鐸，李力群，張峻松

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；3.內(nèi)蒙古煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010

0 引言

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)為麥角菌科蟲草屬真菌，是由冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上形成的復(fù)合體，冬蟲指蝙蝠蛾科幼蟲尸體，夏草指冬蟲夏草菌形成的子座。我國(guó)優(yōu)質(zhì)天然冬蟲夏草多產(chǎn)于海拔3000～5100 m的高原高山草甸區(qū)[1-5]，青海、西藏、四川、云南等地為其主要產(chǎn)地。冬蟲夏草為傳統(tǒng)名貴藥材，藥用歷史悠久，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有止血、益肺、補(bǔ)氣血等功效，現(xiàn)代藥理學(xué)還證明其具有抗癌抗腫瘤、護(hù)肝、增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)活性、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)心腦血管機(jī)能等功效[6-9]。具體來說，冬蟲夏草中的多糖類和糖醇類物質(zhì)(如蟲草多糖、蟲草酸等)具有抗肝纖維化、降血糖、清除自由基和抗腫瘤作用[10-12]。熱裂解-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可通過對(duì)卷煙燃燒過程的模擬，實(shí)現(xiàn)對(duì)裂解產(chǎn)物的在線分析，在煙草研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[13-16]。目前研究者多關(guān)注冬蟲夏草的有效成分在藥理學(xué)方面的功效[17-20]，而鮮見有關(guān)冬蟲夏草提取液中的香味成分分析及其特征成分在卷煙中的熱裂解行為的研究。

基于此，本文擬采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)冬蟲夏草提取液香味成分組成進(jìn)行分析，應(yīng)用熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Py-GC-MS)對(duì)特征成分蟲草酸和蟲草多糖裂解產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析，并按照中式卷煙的風(fēng)格評(píng)價(jià)方法明確香味成分特征及其對(duì)卷煙感官品質(zhì)的貢獻(xiàn)，以期為進(jìn)一步研究冬蟲夏草特征成分在卷煙中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

主要材料：冬蟲夏草粉、空白卷煙葉組，內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司提供。

主要試劑：乙酸苯乙酯(純度>98%)，購于北京百靈威科技有限公司；乙醚、丙酮、無水乙醇、二氯甲烷，均為分析純，購于北京化工廠。

主要儀器：8890B/5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)；Frontier-EGAPY 3030 D型多功能高溫?zé)崃呀鈨x(Py)，日本Frontier LAB公司產(chǎn)；BSA323 S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 冬蟲夏草提取液香味成分分離與分析

1)冬蟲夏草提取液制備

精確稱取2.000 0 g冬蟲夏草粉末加入10 mL 75%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的乙醇溶液，在120 ℃條件下回流提取3 h，離心過濾，提取2次，合并濾液，用75%的乙醇溶液定容至50 mL，得到冬蟲夏草提取液。

2)香味成分分離

稱取5 g冬蟲夏草提取液于1000 mL三口圓底燒瓶中，加入350 mL蒸餾水和30 g氯化鈉，圓底燒瓶一端連接自行設(shè)計(jì)的同時(shí)蒸餾萃取裝置。同時(shí)蒸餾萃取裝置的另一端連接濃縮瓶，濃縮瓶中加入60 mL二氯甲烷，在60 ℃的水浴中同時(shí)蒸餾萃取2.5 h，結(jié)束后，在濃縮瓶中加入1 mL內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯(0.275 mg/mL)溶液。將萃取液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮至1.0 mL，移至色譜瓶中進(jìn)行進(jìn)樣分析。

3)香味成分分析

色譜條件：色譜柱HP-5 MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度280 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比5∶1，載氣He(1.0 mL/min)，升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持20 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，EI源電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

1.2.2 冬蟲夏草特征成分的分離純化

1)蟲草酸的分離純化

精確稱取2.000 0 g冬蟲夏草粉末，在粉末中加入20 mL 95%的乙醇溶液，90 ℃水浴回流提取1 h，過濾提取2次，合并濾液，得冬蟲夏草乙醇提取液(保留該過程產(chǎn)生的冬蟲夏草乙醇提取濾渣，用于蟲草多糖提取)；將冬蟲夏草乙醇提取液減壓濃縮至原體積的1/5，然后將濃縮液靜置至室溫，冷卻，沉淀析出，離心，沉淀物真空干燥，得到蟲草酸粗品。

精確稱取一定量的蟲草酸粗品，加入10倍質(zhì)量的蒸餾水，磁力攪拌至其完全溶解，2000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液，將上清液與有機(jī)溶劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)按 3∶1的體積比混合，裝入分液漏斗中，劇烈振蕩20 min，靜置，取上清液。上清液按Sevag法重復(fù)脫蛋白，直至水相和氯仿相之間無明顯的蛋白沉淀為止。水相加入5倍體積的無水乙醇，放入冰箱中，靜置過夜，有白色晶體析出；過濾，沉淀用無水乙醇洗滌3次，干燥即得除蛋白蟲草酸。

精確稱取一定量的除蛋白蟲草酸樣品，加入10倍質(zhì)量的50%乙醇溶液，加熱并磁力攪拌，使其全部溶解，然后冷卻至室溫，靜置2 h以上，過濾，用無水乙醇洗滌沉淀3次，干燥即得蟲草酸純品，氣相色譜檢測(cè)其純度為98.52%。

2)蟲草多糖的分離純化

在冬蟲夏草乙醇提取濾渣中加入一定量的水，在80 ℃水浴條件下浸提3 h，過濾，浸提2次，合并濾液并濃縮，然后向濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇以沉淀多糖，靜置2 h以上。過濾，沉淀依次以乙醚、丙酮、無水乙醇洗滌，脫水干燥即得蟲草多糖粗品。

將所得蟲草多糖粗品用20倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，所得溶液與有機(jī)溶劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)按 3∶1體積混合，裝入分液漏斗中，劇烈振蕩20 min，靜置取上清液。上清液按Sevag法重復(fù)脫蛋白，直至水相和氯仿相之間無明顯的蛋白沉淀為止。水相加入4倍體積的無水乙醇以沉淀多糖，靜置2 h以上，過濾，沉淀用無水乙醇洗滌3次，干燥即得蟲草多糖純品，利用硫酸-苯酚法測(cè)定其純度為95.39%。

1.2.3 冬蟲夏草特征成分的熱裂解分析

1)蟲草酸和蟲草多糖的熱裂解條件

卷煙熱解蒸餾區(qū)的溫度約為200～900 ℃，大部分煙氣成分產(chǎn)生于該溫度區(qū)間，因此借鑒以往經(jīng)驗(yàn)分別選擇300 ℃、600 ℃、900 ℃對(duì)冬蟲夏草的特征成分進(jìn)行熱裂解分析。稱取一定量的蟲草酸純品和蟲草多糖純品，放置于多功能高溫?zé)崃呀鈨x樣品杯中，按照設(shè)定的熱裂解條件進(jìn)行熱裂解。熱裂解條件為：裂解溫度300 ℃、600 ℃、900 ℃，持續(xù)時(shí)間10 s，初始溫度30 ℃，升溫速率20.00 ℃/ms，載氣為氮?dú)狻?/p>

2)熱裂解產(chǎn)物分析條件

將多功能高溫?zé)崃呀鈨x與GC-MS串聯(lián)，構(gòu)成熱裂解-氣相色譜-質(zhì)譜分析系統(tǒng)，對(duì)蟲草酸和蟲草多糖的裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析。

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度為280 ℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1，載氣為氦氣，氣相色譜柱選用型號(hào)為DB-5 MS的彈性石英毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，氣相色譜升溫程序?yàn)?0 ℃,保持2 min，以4 ℃/min的速率升溫至280 ℃,保持10 min。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，EI源電子能量為70 eV，電子倍增器電壓為1600 V，質(zhì)量掃描范圍為30～550 amu。

用WILEY和NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對(duì)熱裂解產(chǎn)物揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，并采用面積歸一化法測(cè)定其含量。

1.2.4 感官評(píng)價(jià)方法將冬蟲夏草提取液用20%乙醇溶液稀釋成1%(體積分?jǐn)?shù))的稀釋液。取空白卷煙葉組100 g，按照卷煙工藝要求用量，定量移取冬蟲夏草稀釋液，采用醫(yī)用噴霧器，將冬蟲夏草稀釋液均勻噴灑在葉組中，作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組的卷煙葉組樣品采用相同體積的乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為20%)進(jìn)行處理。將處理后的煙組樣品密閉貯存約4 h，采用低溫處理將煙葉烘干后，手工制成卷煙。將卷制好的樣品卷煙按照《卷煙 第4部分：感官技術(shù)要求》(GB 5606.4—2005)[21]的規(guī)定，單層放置在(22±2) ℃、相對(duì)濕度(60±2)%的恒溫恒濕箱內(nèi)48 h，將水分含量平衡至(12±1)%。

由7名內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司評(píng)吸委員會(huì)評(píng)委對(duì)平衡好的卷煙進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，按照中式卷煙的風(fēng)格評(píng)價(jià)方法[22]進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 冬蟲夏草提取液香味成分分析

對(duì)冬蟲夏草提取液香味成分進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示。由表1可知，冬蟲夏草提取液中的香味成分種類較多，主要有丁二酮、乳酸乙酯、γ-丁內(nèi)酯、丁酰乳酸丁酯、椰子醛等成分，這些香味成分可明顯提升和豐富卷煙的奶甜香韻。此外，提取液中的苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰樣花香，可增加卷煙煙氣的回甜感；辛酸乙酯具有白蘭地酒和菠蘿樣香氣，具有柔和煙氣、增補(bǔ)烤煙特征香的作用；壬酸乙酯具有油脂、水果和白蘭地酒樣香氣，可使煙氣柔和細(xì)膩。嗅覺評(píng)價(jià)結(jié)果表明，冬蟲夏草提取液香韻豐富，主要以奶甜香為主，輔以甜香、果香、酒香等香韻。

表1 冬蟲夏草提取液香味成分分析結(jié)果Table 1 The analysis results of the aroma components in the extract of Cordyceps sinensis extract

2.2 蟲草酸的熱裂解產(chǎn)物分析

蟲草酸熱裂解產(chǎn)物分析結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，蟲草酸在熱裂解過程中生成了酯類、醛酮類、醇類、酸類、雜環(huán)類等物質(zhì)，這些物質(zhì)呈現(xiàn)出花香、酒香、青香、烤香、果香、甜香等多種香韻，對(duì)于塑造卷煙風(fēng)味、提升卷煙品質(zhì)具有重要作用。裂解產(chǎn)物的種類隨著裂解溫度的升高而增加，裂解溫度為300 ℃時(shí)共檢出化合物23種，占總峰面積的81.95%，含量最高的物質(zhì)為棕櫚酸(16.82%)，其次是棕櫚酸-s-丁酯 (13.76%)和月桂酸(7.92%)；當(dāng)裂解溫度為600 ℃時(shí)共檢出化合物16種，占總峰面積的42.70%，檢測(cè)到含量最高的是β-D-呋喃半乳糖酯(18.18%)，其次是5-甲基噻唑(3.42%)、山梨醇(3.23%)和月桂酸(3.23%)；當(dāng)裂解溫度為900 ℃時(shí)，共檢出化合物18種，占總峰面積的98.05%，主要組分為碳水化合物，其中裂解產(chǎn)物含量最高的仍為β-D-呋喃半乳糖酯(23.85%)，其次是1,4-酐-D-葡萄糖醇(14.40%)和月桂酸(12.01%)。

表2 蟲草酸熱裂解產(chǎn)物分析結(jié)果Table 2 The analysis results of the pyrolysis products of cord yceptic acid

2.3 蟲草多糖的熱裂解產(chǎn)物分析

蟲草多糖的熱裂解產(chǎn)物分析結(jié)果如表3所示。由表3可知，蟲草多糖在熱裂解過程中可以釋放出小分子的脫水單糖和小分子的醛、酮類物質(zhì)，其中D-阿洛糖出現(xiàn)比例均較高，D-阿洛糖是葡萄糖的C3差相異構(gòu)體，說明在卷煙燃吸時(shí)D-阿洛糖有可能會(huì)轉(zhuǎn)移至主流煙氣中，為改善卷煙的甜味提供一定的幫助。在300 ℃條件下進(jìn)行熱裂解，共檢測(cè)出化合物22種(匹配度大于80%)，含量最高的為D-阿洛糖，其次為1,6-脫水-β-D-葡萄糖；在600 ℃裂解溫度下，共檢出化合物41種(匹配度大于80%)，含量最高的也為D-阿洛糖，其次為1,4-脫水-甘露醇；在900 ℃裂解溫度下，共檢出化合物50種，含量最高的仍為D-阿洛糖，其次為1,5-脫水-D-半乳糖醇。從裂解產(chǎn)物中亦可以推斷出蟲草多糖的結(jié)構(gòu)中有較多的葡萄糖、甘露糖、半乳糖醇單元。

表3 蟲草多糖熱裂解產(chǎn)物分析結(jié)果Table 3 The analysis results of the pyrolysis products of cordyceps polysaccharide

表3(續(xù))

2.4 冬蟲夏草提取液對(duì)卷煙風(fēng)格的影響

冬蟲夏草提取液制備的卷煙樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表4所示,其中香氣風(fēng)格各項(xiàng)指標(biāo)通過嗅香和評(píng)吸確定得分，分值分別為0～3分、0～10分；口味風(fēng)格、舒適感特征、煙氣特征各項(xiàng)指標(biāo)僅通過評(píng)吸確定得分，分值分別為0～5分、0～10分、0～10分。由表4的結(jié)果可知，冬蟲夏草提取液對(duì)卷煙香氣風(fēng)格的影響主要表現(xiàn)為：可使奶香香韻、甜香香韻明顯提升，烤煙煙香、清香、果香有所增加；對(duì)口味風(fēng)格的影響主要表現(xiàn)為可改善卷煙甜感；對(duì)舒適感特征的影響則主要表現(xiàn)為可降低口腔刺激/舌部灼燒，減少口腔殘留，增加煙氣收斂感，降低喉部干燥和鼻腔刺激；對(duì)煙氣特征的影響主要表現(xiàn)為提升香氣、增加香氣豐富性、柔和煙氣,使煙氣更細(xì)膩圓潤(rùn)、掩蓋雜氣。

表4 冬蟲夏草提取液制備的卷煙樣品感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 4 The sensory evaluation results of cigarette samples prepared by Cordyceps sinensis extract 分

3 結(jié)論

本文通過對(duì)冬蟲夏草提取液進(jìn)行香味成分分析，共檢出香味成分59種，其中主要包括丁二酮、乳酸乙酯、γ-丁內(nèi)酯、丁酰乳酸丁酯、椰子醛等具有奶甜香韻的香味成分。進(jìn)一步針對(duì)冬蟲夏草蟲草酸和蟲草多糖，采用Py-GC-MS在300 ℃、600 ℃、900 ℃下進(jìn)行裂解產(chǎn)物分析，確定了蟲草酸和蟲草多糖在熱裂解過程中可以釋放出小分子的脫水單糖和小分子的醛、酮類等物質(zhì)，這些物質(zhì)呈現(xiàn)出多種香韻風(fēng)格，對(duì)于塑造卷煙特色風(fēng)格、提升品質(zhì)具有重要作用。將冬蟲夏草提取液添加至卷煙中，通過感官評(píng)吸發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草提取液對(duì)卷煙香氣風(fēng)格的影響主要表現(xiàn)為可明顯提升奶香香韻、甜香香韻，增補(bǔ)烤煙煙香、清香、果香；在口味風(fēng)格方面為可提升卷煙甜感；在舒適感特征方面可降低口腔刺激/舌部灼燒，減少口腔殘留，增加煙氣收斂感，降低喉部干燥和鼻腔刺激；在煙氣特征方面可提升香氣、增加香氣豐富性、柔和煙氣使煙氣更細(xì)膩圓潤(rùn)、掩蓋雜氣。冬蟲夏草提取液中含有能呈現(xiàn)多種香韻的化合物，這些物質(zhì)是賦予卷煙特色風(fēng)格的關(guān)鍵物質(zhì)，而具體每種香味物質(zhì)對(duì)卷煙感官作用的影響過程及機(jī)理則是下一步的研究方向。