大鰭鳠GHR 基因CDS 區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

葛玲瑞，劉科均，張建國

（湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410127）

生長激素（growth hormone，GH）是動物腦垂體分泌的、具有促進(jìn)機(jī)體生長和蛋白合成等作用的單鏈多肽。GH 與生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）結(jié)合，可以啟動信號傳導(dǎo)促進(jìn)胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ）的表達(dá)，而IGF-Ⅰ通過血液循環(huán)運(yùn)往各個(gè)組織，開啟促進(jìn)動物體生長的功能[1]。GH 效應(yīng)的發(fā)揮主要受組織中GHR 數(shù)量及功效的影響[2]。目前已有數(shù)10 種魚類的GHR基因被克隆，包括金魚（Carassius auratus）[3]、黃顙魚[4]、河川沙塘鱧[5]、建鯉[6]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[7]、南方鲇（Silurus meridionalis）[8]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[9]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[10]、黃鰭鯛（Sparus latus）[11]等。

大鰭鳠（Hemibagrus macropterus）屬鲇形目鲿科鳠屬，其肉質(zhì)細(xì)嫩、骨刺少，為優(yōu)質(zhì)食用魚，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前對大鰭鳠的研究主要集中在繁殖生物學(xué)[12]、遺傳多樣性[13]及其免疫[14-15]等方面，而關(guān)于大鰭鳠生長、抗逆等方面的研究報(bào)道還相對較少，尤其是關(guān)于大鰭鳠GHR基因和GHR基因的生物信息學(xué)分析的研究尚未見報(bào)道?；诖?，筆者利用cDNA 末端快速擴(kuò)增（RACE）的方法成功獲取了大鰭鳠GHR基因的CDS 區(qū)序列，并對大鰭鳠GHR基因CDS 區(qū)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為今后大鰭鳠生長調(diào)控機(jī)制和GHR基因及相關(guān)信號通路的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大鰭鳠樣品取自沅陵輝佳水產(chǎn)養(yǎng)殖合作社養(yǎng)殖基地，體重為（5.34±1.22）g，體長為（6.13±0.42）cm。樣品經(jīng)解剖后取全腦和肝臟組織，投入液氮中速凍后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

其他試驗(yàn)材料包括SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]，TRIzol Reagent、The ReverTra Aceαfirst-strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成從大鰭鳠轉(zhuǎn)錄組中獲得GHR基因的部分序列，設(shè)計(jì)克隆大鰭鳠GHR基因的開放閱讀框（ORF）序列，利用Prime Explorer 軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

表1 大鰭鳠GHR 基因的克隆所用引物

1.2.2 總RNA 提取及cDNA合成取大鰭鳠全腦組織，按照TRIzol法提取總RNA，檢測RNA質(zhì)量和濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后存放于-80℃冰箱保存。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增及克隆測序以大鰭鳠全腦的總RNA 為模板，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，反轉(zhuǎn)錄出全腦的cDNA。通過RACE 技術(shù)，克隆出5'和3'端部分序列并送擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，利用DNAMAN 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得大鰭鳠GHR基因cDNA 序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析利用NCBI 中OFR Finder 程序?qū)Υ篥掲烥HR基因核苷酸序列進(jìn)行開放閱讀框分析；利用NCBI 獲取不同物種GHR基因的核苷酸序列，使用DNAStar 7.0 軟件中的MegAlign 模塊進(jìn)行相似性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ProtParam 分析大鰭鳠GHR 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；使用SignalP 4.1 Server預(yù)測信號肽；利用TMHMM 預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域；使用NetPhos 3.1 Server 預(yù)測磷酸化位點(diǎn)；使用NetNGlyc 1.0 Server 預(yù)測N-糖基化位點(diǎn)；使用YinOYang 1.2 Server預(yù)測O-糖基化位點(diǎn)；使用Cell-Ploc 2.0 進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；利用SPOMA 和Phyre2 分析蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)；利用SMART 預(yù)測蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域和蛋白互作關(guān)系。具體網(wǎng)址如表2 所示。

表2 生物信息學(xué)分析軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 大鰭鳠GHR 基因核苷酸序列及氨基酸序列分析

利用NCBI 中的ORF Finder 對測序得到的大鰭鳠GHR 基因核苷酸序列進(jìn)行了開放閱讀框分析，發(fā)現(xiàn)其ORF 區(qū)長1 731 bp，共計(jì)編碼576 個(gè)氨基酸（圖1）。通過DNAMAN 對序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其核苷酸序列A、T、C、G 含量分別為25.1%、26.7%、24.4%、23.8%。

圖1 大鰭鳠GHR 基因開放閱讀框序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 GHR 基因相似性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將克隆所得大鰭鳠GHR基因CDS 區(qū)序列與其他物種進(jìn)行相似性比對，結(jié)果（圖2）顯示，大鰭鳠GHR基因CDS 區(qū)序列與黃顙魚、斑點(diǎn)叉尾鮰、鯉魚、斑馬魚、牛、人、小鼠、雞和林蛙的相似性分別為90.3%、88.7%、66.9%、65.7%、44.2%、46.2%、46.2%、48.2%和45.8%；其中，大鰭鳠GHR基因核苷酸序列與黃顙魚的相似性最高，與林蛙的相似性最低。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）發(fā)現(xiàn)，大鰭鳠、黃顙魚等魚類與哺乳動物進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 大鰭鳠GHR 基因不同物種間相似性分析

圖3 大鰭鳠GHR 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 大鰭鳠GHR 蛋白的理化特性、跨膜區(qū)和信號肽預(yù)測使用ProtParam 程序?qū)Υ篥掲烥HR 蛋白理化特性、跨膜區(qū)和信號肽進(jìn)行預(yù)測分析，大鰭鳠GHR 蛋白分子式為C2900H4483N765O888S28，分子量為65 170.77，理論等電點(diǎn)為4.94，是一種堿性蛋白。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為55.81，為不穩(wěn)定蛋白；半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為83.16，總平均親水性為-0.368，為親水性蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白區(qū)分剪切位點(diǎn)的C 值為0.704，區(qū)分信號肽位置區(qū)域的S 值為0.939，Y 值為0.758，大于設(shè)定閾值（0.5），表明該蛋白有信號肽結(jié)構(gòu)，屬于分泌蛋白，信號肽剪切氨基酸位點(diǎn)在第22 和23 位之間（圖4）。該蛋白有1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸序列的第254～273 位，屬于跨膜蛋白（圖5）。

圖5 大鰭鳠GHR 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.3.2 大鰭鳠GHR 蛋白的磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測預(yù)測分析結(jié)果（圖6）顯示，GHR 蛋白有34 個(gè)絲氨酸修飾位點(diǎn)和21 個(gè)蘇氨酸修飾位點(diǎn)（圖6A），可能有13 個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn)（圖6B）和有91 個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn)（圖6C）。

圖6 大鰭鳠GHR 蛋白磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測

2.3.3 大鰭鳠GHR 蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，大鰭鳠GHR 蛋白主要是由α-螺旋（20.66%）、延伸鏈（24.13%）和無規(guī)則卷曲（55.21%）組成（圖7）。該蛋白的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)相符（圖8）。

圖7 大鰭鳠GHR 蛋白二級結(jié)構(gòu)

圖8 大鰭鳠GHR 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.4 大鰭鳠GHR 蛋白的亞細(xì)胞定位、功能結(jié)構(gòu)域和蛋白互作分析Cell-Ploc 2.0 在線工具預(yù)測結(jié)果顯示，大鰭鳠GHR 蛋白主要在細(xì)胞膜上發(fā)揮作用。由圖9 可知，該蛋白胞外區(qū)含有一段22 個(gè)氨基酸組成的信號肽序列（1～22 aa）、一個(gè)SCOP 結(jié)構(gòu)域（SCOP：38～136 aa）和 一個(gè)FN3 結(jié)構(gòu)域（FN3：140～230 aa），跨膜區(qū)包括跨膜結(jié)構(gòu)域（254～273 aa），胞內(nèi)區(qū)包含GHBP 結(jié)構(gòu)域（GHBP：374～548 aa）。從圖10 中可知，該蛋白與GH1、GH2、CISH、JAK2 和STAT5A 等存在相互作用。

圖9 大鰭鳠GHR 蛋白結(jié)構(gòu)功能結(jié)構(gòu)域分析

圖10 大鰭鳠GHR 蛋白互作分析

3 討 論

有報(bào)道稱，在一些硬骨魚類中存在2 種GHR。該研究通過RCAE 的方法，成功克隆到大鰭鳠的GHR基因，并獲得了其完整的CDS 區(qū)序列，該序列包含1 731 個(gè)堿基，編碼576 個(gè)氨基酸，其蛋白氨基酸數(shù)量與其他魚類有所差異。生物信息學(xué)分析顯示，大鰭鳠GHR 蛋白包含了一個(gè)細(xì)胞外配體結(jié)合域（253 aa）、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（19 aa）和一個(gè)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（174 aa）。大鰭鳠GHR 蛋白屬于跨膜蛋白，其主要定位在細(xì)胞膜上，可作為一種分泌蛋白調(diào)控多種基因表達(dá)[16]。分析發(fā)現(xiàn)，大鰭鳠GHR 蛋白也存在信號肽結(jié)構(gòu)，其切割位點(diǎn)位于第22 和23 個(gè)氨基酸之間。而信號肽可以把蛋白質(zhì)引導(dǎo)到不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)[17]，從而發(fā)揮相應(yīng)功能。從相似性和進(jìn)化分析來看，大鰭鳠與黃顙魚和斑點(diǎn)叉尾鮰的親緣關(guān)系較近，同源性達(dá)到了80%以上，由此說明魚類的GHR基因保守性較好，但是與哺乳動物之間存在較大差異。從大鰭鳠GHR 蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)結(jié)果來看，GHR 蛋白存在著大量的無規(guī)卷曲，占比達(dá)到了55.21%，使得其三級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)。

大鰭鳠GHR 蛋白互作分析表明，該蛋白與GH1、GH2、JAK2 和SATA5 等存在緊密的聯(lián)系和相互作用。在動物體的生長發(fā)育過程中，GH、GHR 所在的GH/IGF 軸發(fā)揮著重要的作用。研究表明，GHR 與GH 相結(jié)合后，能誘發(fā)JAK2 等細(xì)胞因子酪氨酸磷酸化，以4條不同的信號通路傳入細(xì)胞內(nèi)引起一系列的生理效應(yīng)[18]。在絡(luò)氨酸激酶JAK2-STAT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，GH 與GHR 結(jié)合會激活酪氨酸激酶，GHR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就起始于此[19]。GH 還能使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化蛋白（STAT1，STAT3 及STAT5 等）磷酸化，從而調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種代謝活動[20]。JAK2 信號通路主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、信號轉(zhuǎn)錄因子和活化子（STATS），從而引起下游信號的傳導(dǎo)。