miR20a自噬炎癥小體在子宮內(nèi)膜異位組織中表達(dá)及意義

呂冰峰 秦錦龍

1.江蘇省張家港市第二人民醫(yī)院(215600)；2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)機(jī)制尚未清楚，經(jīng)血逆流學(xué)說(shuō)為目前EMs發(fā)病主流學(xué)說(shuō)，但最新研究表明EMs是一個(gè)復(fù)雜的慢性疾病，經(jīng)血逆流很可能只是EMs的誘因，后續(xù)復(fù)雜的基因、免疫與環(huán)境因素間相互作用在EMs進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。微小核糖核酸(RNA))能特異性識(shí)別并結(jié)合到mRNA的3’非翻譯區(qū)，在參與靶基因表達(dá)后進(jìn)行負(fù)調(diào)控。miR20a為該家族成員[1]，與細(xì)胞免疫聯(lián)系緊密，對(duì)EMs患者的自身免疫炎癥性疾病具有調(diào)節(jié)作用[2]；miRNA可調(diào)節(jié)一些炎性因子表達(dá)以控制炎癥，并在某些炎癥小體的相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮調(diào)控作用[3]。炎癥小體是免疫系統(tǒng)重要部分，具有促進(jìn)人體形成天然免疫力，對(duì)細(xì)菌、病毒等有特異性識(shí)別作用[4]。研究表明，細(xì)胞自噬是對(duì)病原微生物引起的炎癥反應(yīng)進(jìn)行的精準(zhǔn)調(diào)控，避免過(guò)度炎癥反應(yīng)對(duì)人體造成的傷害，構(gòu)建成自噬-炎癥小體通路[5]。miRNA能夠從轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，但不會(huì)導(dǎo)致基因消除。miR20a可精細(xì)調(diào)節(jié)自噬-炎癥小體信號(hào)通路，對(duì)治療EMs非常重要[6]。因此，本研究探討miR20a-自噬-炎癥小體通路在EMs發(fā)病中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2019年1月-2020年12月就診于本院婦產(chǎn)科的EMs患者住院病歷，選擇子宮內(nèi)膜組織60例為EMs異位組，年齡(30.4±5.1)歲(24～46歲)；年齡相匹配非ENs女性正常子宮內(nèi)膜組織60例為對(duì)照組，年齡(31.5±6.2)歲(24～48歲)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診Ems；②年齡25～48歲；③月經(jīng)周期正常，處于卵泡期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①拒絕參與本項(xiàng)研究；②并發(fā)心臟病，高血脂等代謝異常的疾??；③并發(fā)嚴(yán)重的感染性和炎癥性等疾??；④并發(fā)器官功能障礙；⑤盆腔炎性腫瘤，多囊卵巢綜合征；⑥妊娠和哺乳期。納入者均自愿簽署協(xié)議書(shū)，研究獲得院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1組織收集與細(xì)胞轉(zhuǎn)染腹腔鏡檢查或手術(shù)刮宮治療取得兩組樣本120份，-55℃儲(chǔ)存。37℃ 5% CO2培養(yǎng)，DMEM含100U/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素+10%胎牛血清。將EMs細(xì)胞以104細(xì)胞/孔密度接種到6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前24h將正常血清更換為無(wú)雙抗100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。將異位組織處理后分為EMs異位細(xì)胞(EMs組，正常培養(yǎng))，脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的EMs異位細(xì)胞(誘導(dǎo)組，加入LPS 10μg/ml)，LPS誘導(dǎo)及mi20a轉(zhuǎn)染的EMs異位細(xì)胞(轉(zhuǎn)染組，加入LPS 10μg/ml和miR20a-inhibitor慢病毒轉(zhuǎn)染)。24h后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2內(nèi)膜組織中miR20a表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)組織中miR20a表達(dá)：采用 Trizol RNA 分離試劑(美國(guó)生命技術(shù)公司)，用TRIzol試劑盒(武漢艾迪抗生物科技有限公司)提取總RNA，以5μl細(xì)胞中總RNA為模板，用TaqMan 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)在安譽(yù)AGS8830-8實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司)行逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。實(shí)驗(yàn)用引物在武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成，上游和下游引物序列分別為：miR-20a:5'-CTCAGTTCCTACGCTTCGCA-3',5'-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3';U6:5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3';實(shí)時(shí)熒光定量PCR，總反應(yīng)體系30 μl,含有5 μl引物對(duì)、5μl cDNA、10μl Power SYBR Green Master Mix試劑(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，反應(yīng)條件：95℃11s；55℃、34s；71℃、1min，45個(gè)循環(huán)。使用U6小核(snRNA)作為對(duì)照分析，以及量化循環(huán)法進(jìn)行相對(duì)量化和計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)4次。

1.2.3血清炎性指標(biāo)水平收集研究對(duì)象血清標(biāo)本，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中白介素-6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)指標(biāo)，江蘇美正生物科技有限公司生產(chǎn)試劑盒，酶標(biāo)儀 550nm處測(cè)定吸光度計(jì)算濃度。

1.2.4細(xì)胞ASC、Caspase-1、Beclin-1表達(dá)水平分別提取異位組織細(xì)胞內(nèi)總蛋白，Western blotting法檢測(cè)蛋白濃度，行電泳后轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，然后取出 PVDF 膜，完成后再次加入4.5%脫脂牛奶封閉后，添加ASC、Caspase-1、Beclin-1和相應(yīng)一抗(1：1000) 5 ℃過(guò)夜，再用 HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(1：5000)室溫孵2h，清洗 PVDF 膜后加入顯色液，曝光顯影，軟件計(jì)算灰度值為蛋白表達(dá)量。

1.3 觀察指標(biāo)

不同組織中miR20a，血清IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β炎癥因子表達(dá)差異，EMs異位組中EMs組、誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染組組織細(xì)胞中ASC、Caspase-1、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)膜組織中miR20a表達(dá)

PCR 法檢測(cè)顯示，EMs異位組miR20a的表達(dá)水平(2.46±0.32)高于對(duì)照組(1.08±0.22)(t=14.345，P=0.003)。

2.2 血清炎癥因子水平

血清IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β水平EMs異位組均高于對(duì)照組，且在EMs組、誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染組中依次升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清中炎癥因子水平比較

2.3 異位組織細(xì)胞中炎癥小體和自噬蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

Western blotting法檢測(cè)結(jié)果顯示，EMs組、誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中ASC、Caspase-1、LC3、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均依次增加(P<0.05)。表2。

表2 各組組織細(xì)胞炎癥小體和自噬蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較(灰度值，

3 討論

多項(xiàng)研究顯示[7]，miRNA可與靶基因mRNA進(jìn)行堿基配對(duì)來(lái)阻礙翻譯過(guò)程，具有一定的時(shí)序性和功能特異性，在很多炎癥疾病、腫瘤疾病中發(fā)揮著至關(guān)重要作用[8]。miRNA是一個(gè)可以調(diào)控基因表達(dá)作用的重要因子。miR20a是miRNA家族成員，可抑制或降解相應(yīng)靶細(xì)胞參與細(xì)胞的增殖和分化，還可以調(diào)控炎癥因子等生理過(guò)程。胡鴻澤等[9]研究表明，miRNA可能參與了子宮內(nèi)膜癥的發(fā)生進(jìn)展過(guò)程。多項(xiàng)研究表明[10]，miRNA對(duì)炎癥小體起著負(fù)調(diào)控作用，其轉(zhuǎn)錄后活性喪失導(dǎo)致無(wú)法執(zhí)行其翻譯功能，從而導(dǎo)致大量炎癥小體產(chǎn)生。EMs患者炎癥小體異常增多，導(dǎo)致病情更加嚴(yán)重[11]。炎癥小體可導(dǎo)致炎性因子白介素1-β的釋放，使人體天然免疫系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分。在分子生物學(xué)水平層面上，炎癥小體不僅可參與人體免疫調(diào)節(jié)，而且參與細(xì)胞自噬過(guò)程[12]。范為民[13]研究表明，自噬和炎癥小體在功能上聯(lián)系非常密切，與機(jī)體內(nèi)的新陳代謝和穩(wěn)定性維持直接聯(lián)系，嚴(yán)格調(diào)節(jié)炎癥因子和病原體的清除。自噬常常會(huì)識(shí)別并吞滅炎癥小體的各個(gè)組成部分，從而抑制其激活。miR20a、炎癥小體、自噬3者間相互具有調(diào)控作用，miR20a對(duì)EMs治療起著重要作用。miR20a-自噬-炎癥小體通路廣泛參與各種生理和病理過(guò)程，是目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，EMs異位組織中miR20a表達(dá)水平高于正常內(nèi)膜組織，表明miR20a表達(dá)在EMs異位細(xì)胞中異常增高，可能是導(dǎo)致EMs病情的原因之一。分析認(rèn)為：miR20a異常表達(dá)激活炎癥小體通路蛋白，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境失調(diào)繼而病情惡化。炎性指標(biāo)IL-6可促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)育成熟、異常增長(zhǎng)，導(dǎo)致EMs患者產(chǎn)生炎癥，子宮內(nèi)膜相應(yīng)遭到損傷；TNF-α在組織中過(guò)量表達(dá)會(huì)損害子宮內(nèi)膜，促進(jìn)子宮內(nèi)膜炎癥發(fā)展；IL-1β可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖分化，與核因子受體激活劑起著協(xié)同作用，誘導(dǎo)更多的核基因表達(dá)導(dǎo)致病情加重。本文EMs異位組血清IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β水平均高于對(duì)照組，提示EMs異位者炎癥因子水平異常升高可能參與了EMs的發(fā)生；對(duì)EMs異位組不同誘導(dǎo)情況發(fā)現(xiàn)，EMs組、誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染組IL-6、CRP、TNF-α、IL-1β依次升高，表明miR20a參與了EMs病情發(fā)展，可促進(jìn)炎癥因子增加，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。EMs組、誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)染組異位組織細(xì)胞中ASC、Caspase-1、LC3、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量依次增加，表明過(guò)表達(dá)miR20a促進(jìn)了自噬蛋白和炎癥小體的表達(dá)量增加，提示miR20a可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬-炎癥小體通路體現(xiàn)其抗炎作用。

綜上所述，miR20a的表達(dá)可促進(jìn)自噬-炎癥小體信號(hào)通路的激活，促進(jìn)EMs患者炎癥因子增加，減輕子宮內(nèi)膜細(xì)胞損傷，增強(qiáng)EMs細(xì)胞活性，從而發(fā)揮對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的修護(hù)作用。提示miR20a可作為EMs診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，miR20a-自噬-炎癥小體通路也為治療EMs提供新思路。