ERK1/2和NF-κBp65在EMs模型大鼠內膜中的表達及意義

王 芳 李詠梅 商麗紅 楊玉娥 陳 華 哈春芳,3*

1.寧夏醫(yī)科大學臨床學院(銀川，750004)；2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院；3.寧夏醫(yī)科大學生育力保持教育部重點實驗室

子宮內膜異位癥(EMs)是育齡期婦女的一種常見且復雜的慢性炎癥性全身性系統(tǒng)性疾病。據報道，其發(fā)病率在育齡女性中占6%～10%，在不孕的婦女中增加到50%，臨床主要表現(xiàn)為盆腔疼痛、痛經和不孕[1-2]。EMs發(fā)病機制目前仍主要基于Sampson最早提出的“經血逆流學說”，但卻無法解釋育齡期女性中僅8%～10%的發(fā)生率，這表明EMs的發(fā)生還與其他因素有關[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥、卵巢類固醇激素失調、增殖侵襲相關分子及相應的信號通路間復雜的相互作用可能在EMs的發(fā)病機制中起著重要作用[5-6]。細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)可將細胞外刺激信號傳遞至細胞內，通過整合多個細胞內信號模塊參與調節(jié)腫瘤發(fā)生的許多細胞過程，包括調節(jié)細胞增殖、侵襲、遷移和轉移等[7]。核因子κB(NF-κB)是多種信號通路的中樞元件和重要的轉錄因子。在調節(jié)機體免疫炎癥反應和細胞增殖、遷移侵襲及多種腫瘤轉移的過程中都起著重要作用，越來越多的證據顯示NF-κB的異?；罨瘏⑴c了EMs發(fā)生的多種病理生理過程，但促使其活化轉錄并發(fā)揮生物學作用的具體機制仍不清楚。有研究報道，NF-κB在腫瘤中的激活可能是某些環(huán)節(jié)發(fā)生異常導致上游調節(jié)因子如MAPK/ERK途徑的激活而實現(xiàn)[8-10]。因此本研究建立EMs大鼠模型，通過免疫組織化學法及Western blot法檢測EMs大鼠在位內膜及異位內膜組織中ERK1/2、NF-κBp65及增殖侵襲相關蛋白增殖細胞核抗原(PCNA)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達，探討ERK1/2及NF-κBp65蛋白在EMs發(fā)生發(fā)展中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級健康雌性未孕SD大鼠20只，6～8周齡，體質量(200±20)g，購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。自由光照，常規(guī)飼養(yǎng)。本研究方案得到了寧夏醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會的批準。

1.2 主要實驗試劑

兔多克隆抗體ERK1/2(ab17942)購自英國Abcam公司，兔多克隆抗體NF-κBp65(AF0874)購自Affinity公司、兔多克隆抗體PCNA(24036-1-AP)及MMP9(27306-1-AP)均購自武漢三鷹公司。免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒均購置于北京中杉金橋公司，BCA蛋白提取試劑盒和蛋白檢測試劑盒購自凱基公司。

1.3 方法

1.3.1實驗動物模型構建所有大鼠適應性喂養(yǎng)1周，采用自體移植法建立EMs大鼠模型[11]。所有大鼠均用1%戊巴比妥鈉(35mg/kg)腹腔注射麻醉。腹部備皮常規(guī)消毒，距尿道口上方1cm處縱行開腹，切口長約2cm，逐層分離肌肉、腹膜進腹，在膀胱后面提起分離左側子宮，分別在距離卵巢及宮角分叉處約1cm處結扎，剪下長約1.5cm的左側子宮放入生理鹽水中，分離子宮內膜組織，將其剪成5mm×5mm大小的4塊，分別用6-0無菌絲線縫合固定于左右側腹壁血管豐富處，內膜面面向腹壁，3-0無菌絲線逐層縫合腹腔關腹。術后肌注青霉素3d預防感染。造模4周后，第2次剖腹檢查異位病灶生長情況。造模成功標準：見異位病灶呈囊性增大，形成內含淡黃色清亮或者咖啡色液體，表面及周圍可見血管形成。分別留取對照組在位內膜組織及EMs模型組大鼠在位及異位病灶組織隨機分為兩部分，一部分4%多聚甲醛中固定行石蠟包埋切片染色；一部分留置-80℃冰箱保存，用于Western blot蛋白檢測。

1.3.2 HE染色術后4周第二次剖腹并處死大鼠，取EMs模型組大鼠在位及異位內膜組織與對照組在位內膜組織，室溫下置于4%多聚甲醛液中固定48h，并常規(guī)進行石蠟包埋后組織切片(5μm)，經脫蠟復水，蘇木素染核(5min)，分化液分化(10s)，返藍液返藍(10s)，伊紅染色(5min)，梯度酒精脫水(70%-80%-90%-100%I-100II酒精各3min)，二甲苯透明(3min)，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察各組內膜組織病理學變化。

1.3.3免疫組織化學染色將固定包埋好的蠟塊切成5μm的切片，經二甲苯脫蠟、梯度酒精復水、檸檬酸鈉緩沖液微波抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷滅活(3%過氧化氫溶液室溫避光猝滅15 min)，用山羊血清封閉(室溫封閉60min)，一抗ERK1/2(1:200，ab17942,Abcam)、NF-κBp65(1:100，AF0874，Affnity)、PCNA(1:200, 24036-1-AP, proteintech)、MMP9(1:200,27306-1-AP,proteintech)4℃孵育過夜，第2天室溫孵育45min，PBS洗滌，滴加抗兔二抗覆蓋組織，室溫孵育60min，顯微鏡下觀察DAB染色情況，蘇木素染核，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各因子表達定位情況。

1.4 Western blot蛋白檢測

取大鼠在位及異位內膜組織置于液氮中保存，充分研磨，按照BCA蛋白提取試劑盒和檢測試劑盒說明提取總蛋白并測定蛋白濃度。每個加樣孔上樣20μg 蛋白，電泳、PVDF膜轉膜2h，再經5%脫脂牛奶室溫封閉3～4h，一抗 ERK1/2(1∶1000，ab17942，Abcam)、NF-κBp65(1:1000，AF0874，Affnity)、PCNA(1:1000,24036-1-AP,proteintech)、MMP9(1:500,27306-1-AP,proteintech)、β-actin(1∶5000，AF7018,Affnity)4℃搖床孵育過夜。次日室溫孵育1h，TBST漂洗，加抗兔二抗(1∶10000)，TBST 漂洗，加適量ECL增強液于PVDF膜上放置，在BIO-RAD成像儀中顯影曝光，以β-actin為內參，采用Image J軟件對目的條帶進行掃描分析，根據曝光結果計算蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理方法

所有實驗數(shù)據均使用GraphPad Prism 7統(tǒng)計學軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩樣本比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA分析，Pearson相關分析分析各因子間的相關性，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 EMs模型大鼠組織病理學鑒定

可見異位病灶組織呈囊狀增大，內含淡黃色清亮或者咖啡色液體，表面及周圍可見血管形成；HE染色異位病灶組織見子宮內膜腺上皮細胞呈柱狀生長，內可見多個大小不等的腺體及間質炎癥反應，間質內可見新生血管形成，即為模型建立成功。見圖1(245頁)。

2.2 ERK1/2及NF-κBp65在內膜組織中的表達

免疫組化結果顯示，ERK1/2在EMs在位及異位內膜的腺上皮細胞及腺體胞漿中均有表達。NF-κBp65在EMs在位及異位內膜的腺體、間質及腺上皮細胞的胞漿中均有表達，胞核中也有少量表達，見圖2，3(245頁)。 Western blot結果顯示，與對照組相比，模型組在位及異位內膜組織中ERK1/2、NF-κBp65蛋白表達水平增高，且異位內膜組織中的表達水平高于在位內膜組織(P<0.05)。見表1，圖4(245頁)。

表1 各組內膜中ERK1/2及NF-κBp65蛋白表達水平的比較

2.3 RK1/2與NF-κBp65表達水平的相關性分析

Pearson 相關分析顯示，EMs在位內膜組和異位內膜組中，ERK1/2與NF-κBp65的表達水平均呈正相關(異位內膜組r=0.657，P<0.05；在位內膜組r=0.709，P<0.05)，見圖5(245頁)。

2.4 內膜組織中PCNA、MMP9蛋白表達及表達水平

免疫組化結果顯示，PCNA在EMs在位及異位內膜的腺體及腺上皮細胞胞核及胞漿中均有表達。MMP9在EMs在位及異位內膜的腺體、間質及腺上皮細胞中均有表達，且主要表達于腺體和間質的胞漿中，胞核中也有少量表達。見圖6，7(246頁)。Western blot結果顯示：與對照組相比，EMs模型組在位及異位內膜組織中PCNA、MMP9蛋白表達水平增高，且異位內膜組織中 PCNA及MMP9蛋白表達水平高于在位內膜組織(P<0.05)。見表2，圖8(246頁)。

表2 各組內膜中PCNA及MMP9蛋白表達水平的比較

3 討論

EMs雖在病理形態(tài)學上屬于一種良性病變，但其異位內膜的種植卻涉及增殖、遷移侵襲、轉移等惡性生物學特性。近年來研究表明，多種細胞因子(增殖、侵襲相關因子)的活化表達參與了EMs的發(fā)生發(fā)展。因此本實驗采用自體移植法誘導建立EMs大鼠模型，旨在探討ERK1/2及NF-κBp65蛋白在EMs發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

ERK 作為MAPK傳導途徑中的末端主激酶，包含ERK1和ERK2兩種亞型，受細胞外炎癥因子刺激并由其上游激酶MEK磷酸化激活，通過磷酸化作用機制調節(jié)NF-κB 等多種轉錄因子的活性和基因表達，最終在調控與細胞增殖、侵襲相關基因的轉錄表達中發(fā)揮特定的生物學效應[12-14]。文獻報道，EMs患者腺上皮細胞和間質細胞中ERK1/2表達及磷酸化活化程度明顯增高，提示其可能在EMs發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。Arosh等[16]通過體內外實驗證實，EMs中ERK1/2途徑的抑制降低了體外人子宮內膜異位基質細胞的增殖和生存活力以及體內EMs小鼠模型中子宮內膜異位病變的生長，揭示MAPK / ERK途徑的過度激活對子宮內膜異位病變的增殖、存活和生長的重要性。本研究建立EMs大鼠模型，Western-blot檢測結果顯示 EMs大鼠在位及異位內膜組中ERK1/2蛋白表達水平高于對照組(P<0.05)，且與對照組相比，EMs大鼠在位及異位內膜組中PCNA蛋白表達水平亦增高。進一步揭示ERK1/2途徑的過度激活增加與EMs的發(fā)生發(fā)展密切相關，其可能通過增強異位內膜的增殖能力促進EMs的發(fā)生發(fā)展。

NF-κB是由NF-κBRel蛋白家族中的兩個亞單位P50和p65構成的二聚體復合物。作為備受關注的多種信號通路將細胞外刺激信號轉化為轉錄程序的重要樞紐，在正常和病理條件下調節(jié)細胞信號，靜息狀態(tài)下NF-κB多以惰性復合物的形式與IKBa結合存在于多種細胞類型中，當細胞受到各種細胞外刺激后，活化的NF-κB與其復合物IKBa解離并進入細胞核，參與調節(jié)機體免疫炎癥反應、細胞增殖侵襲等多種生物學效應[17-18]。EMs患者異位組織中NF-κB激活的增加表明它可能在EMs的發(fā)病機制中起作用。據報道，NF-κB作為EMs的重要轉錄調節(jié)因子，NF-κB的過度活化參與了EMs發(fā)生發(fā)展過程中炎癥、免疫等多種病理生理過程[19-20]。研究表明，NF-κBp65在EMs患者的在位及異位內膜組織中表達增高，NF-κBp65 siRNA干擾EMs原代腺上皮細胞后發(fā)現(xiàn)其侵襲性相應減低，揭示NF-κBp65的過度激活可能是介導EMs異位細胞侵襲性增強的關鍵[21-22]。本研究結果顯示：與對照組相比，EMs大鼠在位及異位內膜組織中NF-κBp65蛋白以及MMP9蛋白的表達水平升高，揭示NF-κBp65在EMs中過度激活增強了異位內膜的侵襲能力，可能是EMs發(fā)生及演變過程中的關鍵基因，但EMs中活化NF-κBp65表達增強異位細胞侵襲性的具體上游機制仍不清楚。

分子生物學研究顯示，在調節(jié)細胞生長過程中NF-κB作為ERK的直接下游靶點發(fā)揮著舉足輕重的作用，它可以引發(fā)一系列的抗凋亡基因，并在多個水平上阻斷凋亡級聯(lián)反應[23]。腫瘤學研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在腫瘤中的激活可能是通過炎癥刺激如腫瘤壞死因子α(TNFα)或通過上游調節(jié)因子如MAPK/ERK途徑激活實現(xiàn)，最終導致腫瘤細胞的增殖侵襲[24-25]。本實驗建立EMs大鼠模型，免疫組化及Western-blot結果均證實：與對照組相比，ERK1/2與NF-κBp65在EMs大鼠在位及異位內膜中表達水平升高，且呈二者表達呈正相關，進一步檢測增殖、侵襲相關蛋白(PCNA、MMP9)表達，結果亦表明與對照組相比，EMs模型組異位病灶增殖侵襲性明顯增強，進一步通過體內動物實驗證實兩者的表達與EMs的發(fā)病息息相關，二者表達水平升高可能通過增強異位病灶組織的增殖侵襲能力，促進了EMs的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究表明ERK1/2與NF-κBp65在EMs大鼠內膜組織中表達增高且呈正相關，揭示二者作為信號通路中的關鍵靶點與EMs的發(fā)生緊密相關，可能是誘導EMs發(fā)生的關鍵基因，下一步將繼續(xù)利用EMs大鼠為研究模型并靶向抑制ERK1/2蛋白，檢測靶向治療后異位病灶體積變化，通過體內動物實驗明確ERK1/2與NF-κBp65表達在EMs發(fā)病中的作用，為EMs的藥物靶向治療提供可靠的理論和實驗依據。