磷酸二酯酶PA4781對(duì)銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)能力及毒力的影響

宋瑾萱，張倩楠，王秀青

(寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是假單胞菌屬中的主要種別，在自然界中普遍存在，是極易引起醫(yī)院感染的革蘭陰性條件致病菌。該菌感染主要見于免疫力低下者，如幼兒、年老體弱者，患有惡性腫瘤、艾滋病等免疫功能受損的患者。

環(huán)二鳥苷酸(cyclic-diguanosine monophosphate, c-di-GMP)作為細(xì)菌內(nèi)廣泛存在的一類第二信使分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、黏附、毒力以及生物膜形成等多種生理活動(dòng)，在微生物感染過程中發(fā)揮重要作用[1]。細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP濃度取決于其在胞內(nèi)的合成與分解速率。含GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGCs)可將兩分子的GTP合成c-di-GMP，而含EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域的特異性磷酸二酯酶(PDEs)又可將合成的c-di-GMP催化水解[2]。HD-GYP是參與細(xì)菌第二信使分子c-di-GMP水解的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在霍亂弧菌(Vibriocholerae)El Tor體內(nèi)，HD-GYP蛋白過表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP濃度，減少胞外多糖的產(chǎn)生和生物膜形成[3]。銅綠假單胞菌PAO1基因組編碼三種具有HD-GYP結(jié)構(gòu)域的蛋白：PA4781、PA4108和PA2572。并且PA4781、PA4108和PA2572的突變對(duì)銅綠假單胞菌的生物膜形成及運(yùn)動(dòng)能力有明顯的影響[4]。

PA4781是c-di-GMP的磷酸二酯酶，參與c-di-GMP降解，c-di-GMP影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、生物膜的形成等生理生化過程[4]。眾多生理過程中，運(yùn)動(dòng)能力尤為重要，銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力包括泳動(dòng)(swimming)、叢動(dòng)(swarming)和蹭行運(yùn)動(dòng)(twit-ching)，已被證明與其生物膜形成和致病力都具有顯著的聯(lián)系[5]。胞外多糖是細(xì)菌生物膜最主要的組成成分，在生物膜發(fā)育中具有關(guān)鍵作用。銅綠假單胞菌可以分泌3種胞外多糖，即Psl、Pel和藻酸鹽[6]。Pel多糖和Psl多糖都可以作為生物被膜基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分，不同的胞外多糖對(duì)銅綠假單胞菌的毒力因子及形成生物被膜的能力都有不同的影響。胞外DNA與胞外多糖一樣，在細(xì)菌生物膜形成的初始階段也發(fā)揮重要作用。胞外積累的 DNA 構(gòu)成生物膜的骨架，與胞外多糖共同作用來維持生物膜的穩(wěn)定性[7]。此外，銅綠假單胞菌能夠分泌許多的胞外毒力因子導(dǎo)致宿主細(xì)胞的感染，比如綠膿菌素、外毒素A、彈性蛋白酶、鼠李糖脂等[8]。綠膿菌素不但易滲透細(xì)胞膜，而且能干擾來自宿主細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶和電子的轉(zhuǎn)移過程，產(chǎn)生活性氧(ROS)[9]，被認(rèn)為是主要的毒力因子。彈性蛋白酶是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的3種具有廣泛特異性底物蛋白酶中的一種，這種酶具有組織損傷活性，在局部感染中起重要作用[10]。因此，銅綠假單胞菌的毒力因子及運(yùn)動(dòng)能力在病原菌感染時(shí)起重要作用，研究其機(jī)制對(duì)防治銅綠假單胞菌感染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 銅綠假單胞菌PA03為臨床分離株，由寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，PA4781過表達(dá)株pMP2444-PA4781及敲除株pnCasPA-BEC-ΔPA4781為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[11]，均為單株。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基；叢動(dòng)培養(yǎng)基(g/L)：LB培養(yǎng)基，葡萄糖5 g，瓊脂粉5 g，定容至1 L，105Pa滅菌20 min；泳動(dòng)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉3 g，定容至1 L，105Pa滅菌20 min。

1.1.3 試劑及儀器設(shè)備 硫酸慶大霉素，北京Solarbio公司；細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司。PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；電泳儀，北京六一儀器廠；ABI7500 PCR儀，美國Thermo公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 利用NCBI數(shù)據(jù)庫及Primer Premier 6.0軟件，設(shè)計(jì)相關(guān)基因及1個(gè)內(nèi)參基因(RpoD)的引物序列，用BLAST檢驗(yàn)引物的特異性，并送由上海生工公司合成。引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 復(fù)蘇銅綠假單胞菌野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781于LB平板上37℃倒置培養(yǎng)15 h后，挑取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 180 r/min震蕩過夜培養(yǎng)(為維持質(zhì)粒穩(wěn)定性，需在敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781培養(yǎng)基中加入慶大霉素)，取1%菌液進(jìn)行放大培養(yǎng)約2.5 h，調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝弧?/p>

1.2.2 細(xì)菌運(yùn)動(dòng)試驗(yàn) 提前配制好3種運(yùn)動(dòng)所用的培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至40℃傾注平板，室溫放置，使培養(yǎng)皿蓋上的水蒸氣蒸發(fā)后備用；泳動(dòng)和叢動(dòng)試驗(yàn)分別吸取2 μL調(diào)好濃度的菌液點(diǎn)在平板標(biāo)記位點(diǎn)；蹭行運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)先用槍頭將培養(yǎng)基穿透，于穿透的地方輕點(diǎn)2 μL調(diào)好濃度的菌液。待菌液被培養(yǎng)基吸收后，平穩(wěn)移入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 剛果紅染色法檢測(cè)胞外多糖 提前準(zhǔn)備好LB平板，其中含有20 μg/mL的考馬斯亮藍(lán)、40 μg/mL的剛果紅；吸取5 μL調(diào)好濃度的菌液輕點(diǎn)于LB平板中央，待菌液稍干后移入37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 苯酚-硫酸法檢測(cè)胞外多糖 取調(diào)好濃度的菌液于4℃下13 000 r/min離心20 min，上清液用0.22 μm過濾器除菌，向過濾后的上清液中加入3倍體積的無水乙醇，4℃過夜沉淀，次日4℃下13 000 r/min離心15 min，棄上清，用1 mL蒸餾水重懸管壁上的胞外多糖沉淀。

稱取2.5 mg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖，于25 mL的容量瓶中，制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液10、20、30、40 μL，加蒸餾水補(bǔ)足至100 μL，配制成濃度分別為10、20、30、40 μg/mL的葡萄糖溶液，加入200 μL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速滴加500 μL濃硫酸，混勻后室溫放置10 min，40℃水浴鍋加熱15 min，取出室溫靜置5 min冷卻后于490 nm處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

分別取不同菌株的胞外多糖沉淀，按同樣的方法進(jìn)行顯色，將所得值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)的多糖含量。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 分別取過夜培養(yǎng)的菌液，用酶標(biāo)儀測(cè)量其在600 nm的OD值，用LB培養(yǎng)基稀釋至菌液OD初始值為0.05，接種至96孔板，放置于搖床180 r/min，37℃培養(yǎng)，每隔2 h用酶標(biāo)儀測(cè)量其在600 nm處的OD值，至24 h。用不同時(shí)間測(cè)定獲得的不同OD值繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 胞外DNA試驗(yàn) 分別取培養(yǎng)6、12、24、36 h的野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的菌液1.5 mL 10 000 r/min離心10 min，取上清液與兩倍體積冰凍保存的無水乙醇充分混勻后放入-20℃冰箱30 min，取出后12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 70%乙醇(-20℃預(yù)冷)，隨即12 000 r/min離心10 min，棄上清，放入超凈工作臺(tái)中吹干多余液體，向其中加入20 μL雙蒸水-20℃保存。次日取各個(gè)樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，觀察結(jié)果。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化 取復(fù)蘇后野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781于LB液體培養(yǎng)基中37℃，180 r/min震蕩過夜，過夜培養(yǎng)后，取1%菌液放大培養(yǎng)5 h，按照細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒說明操作，提取細(xì)菌總RNA，并測(cè)定其濃度在合適范圍內(nèi)。

加入各RNA樣品500 ng，按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，42℃孵育15 min，85℃加熱5 s失活EasyScript RT/RI與gDNA Remover，將提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃冷凍保存。

以RpoD為內(nèi)參，以cDNA為模板，引物序列見表1，按照RT-qPCR試劑盒說明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 30 s；94℃ 5 s，60℃ 30 s，45 cycles，60℃單次采集熒光，繪制熔解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.2.8 胞外蛋白酶檢測(cè) 在LB培養(yǎng)基中加入20%的脫脂奶粉溶液10 mL，混勻后傾注平板；將不同檢測(cè)菌株調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪海【? μL輕點(diǎn)于牛奶平板中央，待菌液干燥后將平板正置于37℃培養(yǎng)24 h。觀察牛奶平板中蛋白被水解的透明圈，并測(cè)量、記錄其直徑，即為蛋白酶水解能力。

2 結(jié)果

2.1 PA4781對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力的影響 為研究PA4781對(duì)銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)能力的影響，分別測(cè)定野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的泳動(dòng)、叢動(dòng)和蹭行運(yùn)動(dòng)能力。測(cè)量細(xì)菌運(yùn)動(dòng)直徑并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相比于野生型菌株P(guān)A03，PA4781敲除菌株的泳動(dòng)能力減弱，PA4781過表達(dá)菌株的泳動(dòng)能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1。與PA03野生型菌株相比，PA4781敲除菌株的叢動(dòng)能力減弱，PA4781過表達(dá)菌株的叢動(dòng)能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖2。相比于PA03野生型菌株，PA4781敲除菌株的蹭行運(yùn)動(dòng)能力減弱，PA4781過表達(dá)菌株的蹭行運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

進(jìn)一步研究PA4781與蹭行運(yùn)動(dòng)相關(guān)的PilZ基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，結(jié)果表明，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的PilZ mRNA的相對(duì)表達(dá)量下降，過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的PilZ mRNA的相對(duì)表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

2.2 PA4781對(duì)細(xì)菌胞外多糖的影響 對(duì)銅綠假單胞菌胞外多糖的表型進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，相比于野生型菌株P(guān)A03，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781剛果紅染色加深，分泌的胞外多糖增多；過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781染色變淺，分泌的胞外多糖減少，見圖5。

采用苯酚-硫酸法定量測(cè)定銅綠假單胞菌胞外多糖的量，繪制葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線方程為y=0.000 89x+0.108 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 4，多糖含量的高低與吸光度呈線性關(guān)系。然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的糖濃度，并計(jì)算樣品糖含量。結(jié)果顯示，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的胞外多糖產(chǎn)量增多；過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的胞外多糖產(chǎn)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖7。

PelA(PA3064)是Pel多糖合成位點(diǎn)基因之一。通過RT-qPCR檢測(cè)PA4781對(duì)PelA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781的PelA mRNA的相對(duì)表達(dá)量增高，過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的PelA mRNA的相對(duì)表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖8，與胞外多糖的表型變化一致。

2.3 PA4781對(duì)細(xì)菌胞外DNA的影響 繪制野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781以及過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，在0～12 h，3株菌株均呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，11 h達(dá)到平臺(tái)期，之后生長(zhǎng)趨于平緩。對(duì)3株菌株生長(zhǎng)曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖9。電泳結(jié)果表明，從6 h開始，胞外DNA開始積累，隨時(shí)間推移，含量逐漸增多，24 h達(dá)到最大；36 h胞外DNA含量已下降。在12、24 h，野生型菌株P(guān)A03的胞外DNA大量積累，相比于野生型菌株P(guān)A03，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的含量相對(duì)較少，見圖10。

2.4 PA4781對(duì)PhzM基因表達(dá)的影響 通過RT-qPCR研究控制綠膿菌素產(chǎn)生的基因PhzM(PA4209)mRNA的變化。結(jié)果顯示，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的PhzM mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于野生型菌株P(guān)A03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖11。

2.5 PA4781對(duì)細(xì)菌胞外蛋白酶的影響 通過對(duì)菌斑在牛奶平板中透明圈的直徑進(jìn)行測(cè)量并統(tǒng)計(jì)分析，與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的蛋白酶水解能力均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖12。

3 討論

銅綠假單胞菌是引起醫(yī)院感染的主要條件性致病菌之一。c-di-GMP作為細(xì)菌中普遍存在的第二信使，不但能夠調(diào)控鞭毛和纖毛的形成，而且還能通過調(diào)控因子或與蛋白結(jié)合來間接或直接地調(diào)控細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性[12]。銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)包括泳動(dòng)、叢動(dòng)和蹭行運(yùn)動(dòng)，這些運(yùn)動(dòng)能力在感染過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細(xì)菌的泳動(dòng)主要依賴于鞭毛提供動(dòng)力[13]，叢動(dòng)依賴于鞭毛和Ⅳ型菌毛的共同作用，蹭行運(yùn)動(dòng)同樣依賴于鞭毛的運(yùn)動(dòng)和Ⅳ型菌毛的伸展和收縮，使得銅綠假單胞菌在感染時(shí)可以迅速到達(dá)感染部位，有利于生物膜的黏附和形成[14]。生物膜的形成增強(qiáng)了細(xì)菌抵御宿主免疫防御系統(tǒng)及抗菌藥物的能力，同時(shí)鞭毛促進(jìn)了細(xì)菌的遷移和擴(kuò)散，進(jìn)而促進(jìn)病原菌與宿主的相互作用[15]。銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力、生物膜的形成及毒力因子的產(chǎn)生都對(duì)患者的感染及遷延不愈有重要的影響，因此，對(duì)于相關(guān)表型的研究尤為重要。

PA4781是銅綠假單胞菌中含有HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶，能夠促進(jìn)c-di-GMP水解。細(xì)胞表面附屬物(主要為鞭毛和Ⅳ型菌毛)通過影響細(xì)菌遷移和固體表面附著，在生物被膜的形成中發(fā)揮重要作用[16]。銅綠假單胞菌能夠通過鞭毛的揮鞭運(yùn)動(dòng)在液體中泳動(dòng)，并能夠通過Ⅳ型菌毛的伸展和收縮在固體表面蹭行。細(xì)菌的這種遷移能力使其在發(fā)育過程中具有廣泛的運(yùn)動(dòng)性、競(jìng)爭(zhēng)性和選擇性[17]。PilZ是一種介導(dǎo)蹭行運(yùn)動(dòng)的Ⅳ型菌毛形成所必須的，被c-di-GMP結(jié)合而激活，幫助生物被膜微菌落的聚集[18]。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的菌株，對(duì)PA4781的功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。通過對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力和Ⅳ型菌毛基因PilZ的研究，發(fā)現(xiàn)PA4781敲除菌株的運(yùn)動(dòng)能力弱于野生型菌株，PA4781過表達(dá)菌株的運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)于野生型菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)PA4781敲除菌株P(guān)ilZ的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于野生型菌株，PA4781過表達(dá)菌株P(guān)ilZ的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于野生型菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，因此說明PA4781可能通過促進(jìn)基因PilZ的表達(dá)，從而增強(qiáng)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力。

研究[4]表明，PA4781對(duì)生物膜的形成有一定的影響，因此，應(yīng)著重于生物膜中兩個(gè)重要的組成成分，胞外多糖和胞外DNA。胞外多糖是生物膜細(xì)胞外基質(zhì)的骨架成分，其黏性使菌細(xì)胞聚集形成封閉環(huán)境以抵御逆境脅迫，而c-di-GMP可經(jīng)合成酶依賴途徑參與調(diào)控胞外多糖的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。研究[20]表明，細(xì)菌內(nèi)高濃度的c-di-GMP可促進(jìn)生物膜形成，低濃度的c-di-GMP可抑制生物膜形成。銅綠假單胞菌可以合成至少3種類型的胞外多糖：褐藻多糖、Pel多糖和Psl多糖。Pel多糖可以將不同種菌株連接在一起，從而促進(jìn)混合生物被膜的形成[21]。Pel多糖還可以與生物被膜基質(zhì)中的另一重要組分，胞外DNA通過正負(fù)離子間相互吸引而交聯(lián)在一起，促進(jìn)生物被膜的穩(wěn)定性。

胞外DNA被認(rèn)為是促進(jìn)銅綠假單胞菌生物被膜形成的重要因子，其既可以作為生物被膜的支撐成分，也可以在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)期為生物膜內(nèi)細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)[22]。胞外DNA的主要結(jié)構(gòu)與細(xì)菌基因組染色體DNA相似，其主要來源于死亡細(xì)菌的裂解、釋放或活細(xì)菌的主動(dòng)分泌，參與細(xì)菌細(xì)胞的初始附著、細(xì)胞-細(xì)胞的互連和生物被膜大菌落的形成。在銅綠假單胞菌生物被膜形成的初期，胞外DNA含量較少，大量DNA的釋放則是在生物膜形成的晚期，這也與晚期有較多細(xì)菌死亡裂解有關(guān)[23]。

通過對(duì)胞外多糖和胞外DNA的含量進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，PA4781過表達(dá)菌株的胞外多糖產(chǎn)生減少，PA4781敲除菌株的胞外多糖產(chǎn)生增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且通過對(duì)控制Pel多糖合成的基因——PelA在轉(zhuǎn)錄水平的變化情況發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，PA4781敲除菌株P(guān)elA的mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，PA4781過表達(dá)菌株P(guān)elA的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明PA4781可能通過抑制基因PelA的表達(dá)，抑制生物膜細(xì)胞外基質(zhì)胞外多糖的產(chǎn)生，從而可能抑制生物膜的形成和穩(wěn)定性；而對(duì)于胞外DNA含量，研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌增殖能力相同的情況下，12 h和24 h(生物膜成熟的階段)時(shí)野生型菌株的胞外DNA大量積累，相比于野生型菌株，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的含量都相對(duì)較少。說明PA4781可能不能直接影響胞外DNA的分泌。

綠膿菌素是一種具有氧化活性的吩嗪類化合物，也是銅綠假單胞菌的重要致病因子。作為銅綠假單胞菌的主要毒力因子，綠膿菌素不僅是該菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子，也是一種電化學(xué)活性代謝物。其被認(rèn)為是細(xì)菌呼吸的電子載體，同時(shí)也能協(xié)調(diào)微生物群落對(duì)環(huán)境變化的反應(yīng)[24]。此外，研究[25]表明，綠膿菌素可以通過誘導(dǎo)H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞裂解促進(jìn)胞外DNA的釋放，從而促進(jìn)生物膜的形成。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，PA4781過表達(dá)菌株綠膿菌素的產(chǎn)生量遠(yuǎn)低于PA4781敲除菌株和野生型菌株，因此檢測(cè)控制綠膿菌素的基因PhzM的表達(dá)量的變化。結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，相比于野生型菌株，PA4781過表達(dá)菌株和PA4781敲除菌株的基因表達(dá)量大幅度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明PA4781可能不能直接影響綠膿菌素的合成，這也可以解釋胞外DNA有同樣的變化，從而引起后期深入的研究。

蛋白水解酶也是銅綠假單胞菌的重要毒力因子之一，包括彈性蛋白酶A和B、堿性蛋白酶等，對(duì)于不同的蛋白都有一定的水解能力，在急性感染中發(fā)揮重要作用。對(duì)野生型菌株P(guān)A03、敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的胞外蛋白酶總活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株P(guān)A03相比，敲除菌株pnCasPA-BEC-ΔPA4781和過表達(dá)菌株pMP2444-PA4781的蛋白酶水解能力均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明PA4781可能不能直接影響銅綠假單胞菌的胞外蛋白水解酶能力。

綜上所述，本研究認(rèn)為，PA4781可能通過促進(jìn)基因PilZ的表達(dá)，從而促進(jìn)銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力；PA4781可能通過抑制基因PelA的表達(dá)，從而抑制胞外多糖的分泌。同時(shí)，PA4781可能不能直接影響胞外DNA分泌量、毒力因子綠膿菌素和胞外蛋白酶的產(chǎn)生。

PA4781作為c-di-GMP的磷酸二酯酶，參與c-di-GMP降解，影響細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、生物膜的形成等眾多生理過程。本研究基于課題組前期在PA4781對(duì)銅綠假單胞菌c-di-GMP及生物膜形成的影響方面的研究，初步探明PA4781對(duì)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力及毒力因子的影響，但PA4781與其他因素共同作用對(duì)細(xì)菌致病因子的影響仍有待進(jìn)一步探討，以期為銅綠假單胞菌感染的治療找到新的靶點(diǎn)，為預(yù)防和治療銅綠假單胞菌感染提供新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。