血凝(HA)試驗(yàn)的改進(jìn)

莫靜華，黎劍威，徐 勒，黃玉淑，韋建華

(廣西壯族自治區(qū)河池市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 河池 547000)

0 引言

一些病毒具有凝集紅細(xì)胞的特性，根據(jù)這個特性再結(jié)合抗原與抗體的特異性結(jié)合的原理，設(shè)計出針對該種病毒的血凝(HA)試驗(yàn)與血凝(HI)抑制試驗(yàn)，通過該試驗(yàn)可以檢測出血清中該病毒的抗體效價情況，從而評價該病毒的疫苗效果情況或是推測感染史。血凝與血凝抑制試驗(yàn)因簡單、快速等特點(diǎn)，是試驗(yàn)室中一種很常用的檢測血清抗體效價的方法。血凝(HA)試驗(yàn)中，血凝價的測定與判定很關(guān)鍵，個人判定常常帶有主觀因素，判定不正確，將影響到血凝(HI)抑制試驗(yàn)4單位抗原的配置，最終影響后續(xù)血清抗體的結(jié)果判定。血凝(HA)試驗(yàn)中，一般為了準(zhǔn)確，需要做3個平行的試驗(yàn)，之后判定血凝價是落在哪一個孔上，這樣做只能得到一個比較寬范圍的數(shù)值，比如血凝價判為512或是1 024，不能準(zhǔn)確的得出具體數(shù)值。本文對血凝(HA)試驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)，使用“素數(shù)”濃度倍比稀釋，錯開重疊濃度比，力求在同等條件下更為準(zhǔn)確地測定血凝價，其過程如下。

1 材料

1.1 儀器

研究需要1.2～20 μL移液器、20～200 μL移液器、8道5～50 μL移液器、微型振蕩器。

1.2 試劑和耗材

試驗(yàn)所需要的試劑和耗材有移液器頭(若干)、一次性90° 96孔“V”型微量反應(yīng)板(1塊)、1%雞紅細(xì)胞、PBS、待測抗原。

2 方法

2.1 加稀釋液

取一次性96孔反應(yīng)板，豎著擺放并按表1抽取稀釋液分別加入反應(yīng)板第一列的各個孔中，其余空白孔全部加入25 μL PBS。第一列加入不同的稀釋液，為下一步倍比稀釋出不同濃度做準(zhǔn)備工作。

表1 第一列稀釋液體積 單位：μL

2.2 稀釋需要的濃度比

使用移液器取80 μL待檢抗原，混于第一孔中，然后分別按照如下體積取液。

在第一孔混勻后取出110 μL的體積混到第三孔(跨過第二孔，豎下來按列加樣)，第一孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:2，如此計算。

在第三孔混勻后取出115 μL的體積混到第四孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:3。

在第四孔混勻后取出142 μL的體積混到第五孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:5。

在第五孔混勻后取出149 μL的體積混到第六孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:7。

在第六孔混勻后取出184 μL的體積混到第七孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:11。

在第七孔混勻后取出167 μL的體積混到第八孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:13。

在第八孔混勻后取出168 μL的體積混到第九孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:17。

在第九孔混勻后取出138 μL的體積混到第十孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:19。

在第十孔混勻后取出117 μL的體積混到第十一孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:23。

在第十一孔混勻取出98 μL的體積混到第十二孔，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:29。

在第十二孔混勻后取出55 μL的體積棄掉，該孔剩下體積為50 μL，其濃度為1:31。

本步驟的目的在于稀釋后濃度比為素數(shù)比，使用素數(shù)比濃度在下一步倍比稀釋放大后，將會稀釋出不重復(fù)的稀釋濃度比。

2.3 倍比稀釋

對第一行第一孔取25 μL進(jìn)行倍比稀釋，直到稀釋到反應(yīng)板的最后一個孔(第八孔)，之后取出25 μL后滴加到第二行的第一孔，然后再進(jìn)行該行的倍比稀釋到第四孔即可。第三行，則取出25 μL以行進(jìn)行倍比稀釋至第八孔，之后棄掉25 μL；其他行均如此進(jìn)行倍比稀釋。

當(dāng)進(jìn)行完畢以上操作之后，反應(yīng)板所有的孔的體積均為25 μL。

最終一次性反應(yīng)板中各個孔的濃度比如表2所示。

表2 最終一次性反應(yīng)板中各個孔的濃度比

3 結(jié)果

3.1 血凝試驗(yàn)結(jié)果

對整塊反應(yīng)板，每個孔分別加入25 μL，1%雞紅細(xì)胞之后，在加入一次25 μL的稀釋液，震蕩25 s后等待30 min看結(jié)果[1]。假設(shè)使用某種方法精確的測出某抗原的真實(shí)血凝價為970，那么利用文中的方法重新測定血凝價，以比較其誤差情況。正確操作后，結(jié)果如表3所示。

表3 改進(jìn)的血凝試驗(yàn)檢測結(jié)果

3.2 結(jié)果的顯示方式

建議打印一張上圖的濃度表，根據(jù)一次性反應(yīng)板上的結(jié)果，在濃度表中使用“+”“-”符號標(biāo)出反應(yīng)板的血凝價的結(jié)果，之后繪制一條直線，把每一行的血凝價的臨界范圍的數(shù)值統(tǒng)一標(biāo)注在這條直線上，縮小范圍，從直線上分別尋找出最小滴度的血凝價和最大滴度血凝價，得到血凝價的臨界范圍，取臨界范圍兩端血凝價數(shù)值進(jìn)行平均，得到一個平均值，這個數(shù)值即為測定的血凝價的最佳數(shù)值，如圖1所示。

圖1 血凝試驗(yàn)結(jié)果繪制直線圖

從圖1中取到臨界范圍(928、992)，兩數(shù)值平均值為:(928+992)/2=960。960即為本方法測定下的最終血凝價。與常規(guī)血凝試驗(yàn)比較可知，如果血凝價定為512，顯然與960相距甚遠(yuǎn)，如果血凝價定為1 024，顯然又不足，一般有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)員就會取中間值:(512+1 024)/2=768，768與970相差202個單位，960與970相差10個單位，經(jīng)比較之后，使用文章中的方法比較接近真實(shí)數(shù)值。

4 討論

1)血凝和血凝抑制試驗(yàn)是實(shí)驗(yàn)室常用的免疫抗體檢測技術(shù)之一，主要用于雞新城疫和禽流感病毒病的檢測診斷以及監(jiān)測雞的免疫狀態(tài)[2]。在進(jìn)行本試驗(yàn)時，需要注意試驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化，這樣保證結(jié)果更具準(zhǔn)確性和可靠性。在進(jìn)行試驗(yàn)前，需要將可能會影響到本試驗(yàn)是一些影響因素進(jìn)行分析，并且采取措施盡量避免這些因素造成對結(jié)果的影響。

首先，紅細(xì)胞的來源和濃度，紅細(xì)胞最好是采集3～4只健康且沒有免疫的禽，這樣可以避免出現(xiàn)紅細(xì)胞自凝的情況[3]，減少這種情況對結(jié)果造成干擾。而且選取紅細(xì)胞的禽需要每半年進(jìn)行更換；紅細(xì)胞要經(jīng)過充分的清洗，將其血清徹底洗去；紅細(xì)胞的濃度通常為0.5%～1%，通常應(yīng)用的濃度為1%。在制作紅細(xì)胞時，一般應(yīng)用3.8%的檸檬酸鈉作為抗凝劑，抗凝劑的配制是在三角瓶中加入100 mL的純水和3.8 g的檸檬酸鈉，將其混合均勻后置于15磅的壓力下經(jīng)過15 min滅菌后，分裝凍存。在采集雞血時，按照1/10的量在注射器中加入檸檬酸鈉，而后與采集到的血液混合后應(yīng)用PBS進(jìn)行清洗，PBS的用量最少為所采集血量的10倍。在清洗紅細(xì)胞時，次數(shù)不能過多，否則容易引起紅細(xì)胞的破裂，通常是在清洗后發(fā)現(xiàn)上清液清亮為宜，如果清洗次數(shù)過多，會表現(xiàn)出清洗液的上清液呈現(xiàn)出淡紅色甚至是紅色，出現(xiàn)紅細(xì)胞的破裂。制備好的紅細(xì)胞，需要通過對其血沉進(jìn)行觀察，將血沉不合格的紅細(xì)胞棄去。這樣制作好的紅細(xì)胞懸液需要在4℃進(jìn)行保存，保存時間不能夠超過2 d。當(dāng)其保存時間過長或者在保存的過程中受到病原菌的污染，會使得紅細(xì)胞出現(xiàn)自凝的情況，從而對血凝試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生影響。如果對所用的紅細(xì)胞進(jìn)行醛化，可使紅細(xì)胞的性質(zhì)變穩(wěn)定，從而更容易保存，即使在蒸餾水中也不會出現(xiàn)溶血情況。這種紅細(xì)胞可以在4℃的條件下保存，最長可以保存1年。而且應(yīng)用這種醛化的紅細(xì)胞使用方便、穩(wěn)定、結(jié)果均一，且容易判定結(jié)果，但反應(yīng)結(jié)果會比用新鮮的紅細(xì)胞效價低1～2個。

其次，緩沖液的配制，在新城疫和禽流感的檢測中，國家標(biāo)準(zhǔn)所應(yīng)用的緩沖體系是0.01 M pH 7.2PBS。這種緩沖液最好在應(yīng)用前進(jìn)行配制，經(jīng)過高壓滅菌后就可以使用，不用時可以放入冰箱中冷藏保存，但保存時間不能超過30 d。當(dāng)取出PBS時，如發(fā)現(xiàn)其中有大量的絮狀沉淀物，就需要將其棄去，不能繼續(xù)使用。通常，PBS在配制好后不需要調(diào)節(jié)pH值，直接經(jīng)過滅菌后冷藏保存即可。如果確實(shí)需要調(diào)節(jié)，可以應(yīng)用NaOH溶液。由于病毒的最適宜pH值6～7.2，因此，需要用酸堿度的緩沖液，當(dāng)緩沖液的pH值低于5.8時，就容易引起紅細(xì)胞的溶血，當(dāng)pH值高于7.8時，則在紅細(xì)胞上吸附的病毒會出現(xiàn)脫落情況，因此，緩沖液配制尤其重要，其對結(jié)果的影響也相當(dāng)大。在調(diào)節(jié)pH值時，要注意應(yīng)用酸度計更為準(zhǔn)確，如果僅僅是用pH試紙，則結(jié)果不準(zhǔn)確。也可以應(yīng)用直接做好的PBS粉進(jìn)行配制，方便，可靠。如果確實(shí)沒有PBS，可以應(yīng)用林格氏液進(jìn)行配制，也具有相似的應(yīng)用效果。

還要注意血凝板和微量振蕩器的應(yīng)用。在進(jìn)行試驗(yàn)時，通常是應(yīng)用一次性的血凝板，這樣可以確保結(jié)果的相對可靠和有效，這種血凝板通常是塑料的，應(yīng)用時也方便，也可以選用可重復(fù)使用的血凝板，通常為聚苯乙烯制成，但在購買時需要注意購買90度角，且底面光滑的板。在應(yīng)用前要檢查孔內(nèi)是否清潔，如果不清潔，需要應(yīng)用蘸有酒精的棉簽對孔內(nèi)進(jìn)行擦拭，待擦干凈后才可以應(yīng)用。這種板的好處是可以上下進(jìn)行疊放，這樣在進(jìn)行大量試驗(yàn)時，可以有效節(jié)省空間。在應(yīng)用完成后，也要應(yīng)用加壓后的高壓水將每個孔都進(jìn)行沖洗，而后將其中的水分甩干后置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行烘干，備用。在應(yīng)用微量振蕩器時，需要注意震動的幅度，幅度不能太大，時間也不能過長，通常10 s左右即可。當(dāng)應(yīng)用多塊血凝板進(jìn)行疊加后震蕩時，要將最上邊的板子下壓，這樣可以避免其中的液體外濺，從而對結(jié)果造成影響。

最后還要關(guān)注器材的使用，通常應(yīng)用單道或者是多道的微量移液器，這種移液器需要在使用前進(jìn)行校正。在使用時要注意將每個吸頭都固定好，避免出現(xiàn)漏氣的情況，并要防止加樣時出現(xiàn)氣泡，而且用力要均勻，這樣可以防止量取不準(zhǔn)的情況。在應(yīng)用時，要注意移液器與血凝板保持垂直，可以使得結(jié)果更準(zhǔn)確。

2)該方法優(yōu)點(diǎn)是在對血凝(HA)試驗(yàn)改進(jìn)之后，利用不同濃度比來對抗原效價進(jìn)行測定，相對于原先血凝價的測定，更為精確，4單位抗原配置也更為可靠。經(jīng)過上述方法測定之后的4單位抗原配置，可以不需要再做回滴試驗(yàn)。在用量方面，使用抗原80 μL，傳統(tǒng)血凝(HA)試驗(yàn)，一般做3個平行試驗(yàn)，每個試驗(yàn)用抗原量為25 μL，總計需要75 μL 的抗原用量，用量方面差不多。試驗(yàn)雖然是對血凝(HA)試驗(yàn)改進(jìn)，但也可以拓展于其他溶液原濃度的測定。上述方法的特點(diǎn)是使用素數(shù)濃度比進(jìn)行倍比稀釋，錯開各個可能會重復(fù)的稀釋度，最終將血凝價鎖定到2個較窄的范圍內(nèi)，最后取兩濃度的“平均”值，通過如此改進(jìn)能更快逼近真實(shí)的血凝價濃度。另外，該方法還可以避免主觀錯誤，某一行判定不確定時，對結(jié)果并不會有很大影響，因?yàn)槠渌械难齼r也會矯正這一行的結(jié)果。應(yīng)用該方法的缺點(diǎn)是稀釋液體積難以控制，試驗(yàn)中使用的是20～200 μL的移液器，精度上得不到保證，經(jīng)過該方法測定的抗原效價仍然沒有算出抗原的真正效價水平。試驗(yàn)只是縮小了效價范圍，所以最后取兩端平均數(shù)較為合理。另一個缺點(diǎn)是，在操作過程中，一次性反應(yīng)板的孔不能容納200 μL的溶液，所以在某些孔的稀釋過程中，就不能將吸頭中的液體全部吹打出去，但是可以進(jìn)行多次緩慢的吹打以達(dá)到使液體混合均勻的目的，這也增加了試驗(yàn)的操作難度。

3)血凝試驗(yàn)的結(jié)果通常僅對當(dāng)次試驗(yàn)有效，當(dāng)過段時間再進(jìn)行試驗(yàn)時，就要對血凝價進(jìn)行重新測定，尤其是在天氣炎熱的夏季。而且血凝價和所用的紅細(xì)胞懸液是進(jìn)行配套使用的，當(dāng)所用的紅細(xì)胞不是同一批時，必須重新測定血凝價，這樣才能確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確。但血凝試驗(yàn)完成后，應(yīng)用的四單位抗原保存也要立即進(jìn)行冷凍后才能夠減少效價的損失。在進(jìn)行血凝試驗(yàn)時，加入紅細(xì)胞后，對結(jié)果的觀察需要經(jīng)過30 min，在氣溫較低的季節(jié)，可以適當(dāng)延長至40 min。直到空白孔中的液體變清亮?xí)r再進(jìn)行讀數(shù)，這樣的結(jié)果才更準(zhǔn)確可靠。

4)該研究通過對血凝試驗(yàn)的傳統(tǒng)方法進(jìn)行改良，可以在臨床應(yīng)用中更準(zhǔn)確地檢測出抗原的效價，這樣在進(jìn)行抗原配制時，就可以更準(zhǔn)確。只有4單位抗原的準(zhǔn)確配制，才能夠在血凝抑制試驗(yàn)中對抗體效價檢測時，獲得準(zhǔn)確的效價，該試驗(yàn)的結(jié)果也更具有參考價值。