高濃度地塞米松對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞小分子非編碼RNA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究▲

周 興 劉 凱 彭建平 王傳東* 張曉玲

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)再生醫(yī)學(xué)與醫(yī)用生物資源開發(fā)應(yīng)用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧市 530021；2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室，上海市 200092)

大約有3%的50歲以上成年人因過敏、炎癥或癌癥而接受糖皮質(zhì)激素治療。長期使用糖皮質(zhì)激素會產(chǎn)生多種副作用，其中骨質(zhì)疏松和骨折是其最常見的不良反應(yīng)[1-5]。地塞米松是臨床常用的一種糖皮質(zhì)激素，亦是骨質(zhì)疏松模型的誘導(dǎo)劑, Deng等[6]的研究表明，地塞米松可通過PI3K/AKT/GSK3β信號通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明高濃度地塞米松處理的大鼠中堿性磷酸酶、骨鈣素等成骨相關(guān)指標(biāo)表達(dá)下調(diào)[7]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)具備多向分化潛能，并且是骨髓中造血系統(tǒng)的關(guān)鍵生態(tài)位細(xì)胞[8]。在再生醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域中，BMSCs因其成骨分化能力以及低免疫原性而成為理想的“種子細(xì)胞”[9]。既往研究也表明，在成人骨髓腔內(nèi)BMSCs是成骨細(xì)胞的主要來源[10]。小分子非編碼RNA(small non-coding RNA, sncRNA)包括轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA，tRNA)、PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNA，piRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、重復(fù)相關(guān)小干擾RNA(repeat associated small interfering RNA，rasiRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)和核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)等[11]。既往研究表明，地塞米松可能通過調(diào)控sncRNA影響骨重建。例如，有研究報(bào)道地塞米松通過下調(diào)miR-34a-5p的表達(dá)激活下游的Notch信號通路從而抑制BMSCs的成骨分化能力[12]。Hong等[13]的研究表明經(jīng)地塞米松治療后的壞死股骨頭組織中miR-579累積增加。Tang等[14]的研究表明過表達(dá)的miR-199a可有效減弱地塞米松對BMSCs成骨分化的抑制作用。然而，地塞米松調(diào)控sncRNA進(jìn)而影響B(tài)MSCs分化的相關(guān)研究目前仍主要集中于miRNA，其他sncRNA的相關(guān)研究較少。

以往的芯片測序方法只能局限于已知序列和結(jié)構(gòu)的sncRNA，而高通量small RNA測序技術(shù)提供了更高的靈敏度，有助于我們發(fā)現(xiàn)新的sncRNA[15-17]。因此，本研究使用高通量small RNA測序技術(shù)，全面地研究地塞米松抑制BMSCs成骨分化過程中sncRNA的表達(dá)譜，以了解地塞米松抑制BMSCs成骨分化的潛在分子機(jī)制，為后續(xù)深入研究激素性骨質(zhì)疏松癥的靶向治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 C57BL/6J小鼠購自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)有限公司。α-MEM培養(yǎng)基(貨號：B1131-053)和胎牛血清(貨號：BN1630-149)購自BIOEXPLORER公司，胰蛋白酶(貨號：25200072)購自ThermoFisher公司，青鏈霉素雙抗(貨號：E607011-0100)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，茜素紅(貨號：A5533)、地塞米松(貨號：D4902)、維生素C(貨號：A5960)和β-甘油磷酸鈉(貨號：G9422)購自Sigma公司。酶標(biāo)儀(型號：infinite M200 PRO)購自TECAN公司。

1.2 C57BL/6J小鼠BMSCs分離培養(yǎng) 取雄性3～4周的C57BL/6J小鼠，使用頸椎脫臼法將其處死，置于75%乙醇中消毒5 min，分離并切除股骨和脛骨上下緣。吸取3 mL左右的α-MEM完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗)將骨頭沖洗至發(fā)白。將骨髓沖洗液接種于6孔板并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。2 d后首次換液，此后每3 d更換一次培養(yǎng)基，約7 d后細(xì)胞長滿，將其繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.3 成骨分化誘導(dǎo) 陰性對照組(negative control，NC組)誘導(dǎo)液為含0.1 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C、104μmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM完全培養(yǎng)基。地塞米松組(dexamethasone，DEX組)誘導(dǎo)液為含10 μmol/L地塞米松、50 μmol/L維生素C、104μmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM完全培養(yǎng)基。將小鼠第3代BMSCs 以2×104個(gè)/cm2的密度接種于6孔板，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待生長融合至60%～70%后，分別更換為NC組和DEX組誘導(dǎo)液繼續(xù)誘導(dǎo),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每3 d更換一次誘導(dǎo)液。

1.4 鈣結(jié)節(jié)染色及半定量測定 精確稱量1.37 g茜素紅粉末溶解于100 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)中，并調(diào)節(jié)pH值為4.1～4.3，放置室溫備用。成骨分化誘導(dǎo)結(jié)束后去除培養(yǎng)基，使用PBS沖洗2遍，加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，再使用PBS沖洗2遍，每孔加入1 mL茜素紅染色液，室溫孵育20 min后吸掉染色液，使用PBS沖洗2遍后進(jìn)行拍照。每孔加入1 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液溶解茜素紅鈣結(jié)節(jié)，然后震蕩混勻，吸取100 μL的裂解液加入96孔板中，利用酶標(biāo)儀檢測548 nm處的吸光度值。

1.5 高通量small RNA測序 NC組和DEX組均在誘導(dǎo)3 d后去除培養(yǎng)基，6孔板中每孔加入2 mL PBS洗滌2遍后棄除，接著在每個(gè)孔中加入1 mL TRIzol試劑溶解RNA，將溶解液放置在-80 ℃冰箱中，樣品提交給生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)主要流程包括從總RNA中分離small RNA、逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增、small RNA建庫純化，最后采用Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行測序。

1.6 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析主要包括使用Trimmomatic軟件過濾原始數(shù)據(jù)、Bowtie軟件比對參考基因組、DESeq2軟件進(jìn)行差異基因分析、R軟件vegan包進(jìn)行主成分分析。miRNA差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為倍數(shù)變化(Fold Change)≥2且P<0.05，piRNA、rasiRNA、snoRNA、snRNA差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為倍數(shù)變化(Fold Change)≥1.5且P<0.05。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 茜素紅染色與鈣結(jié)節(jié)含量檢測結(jié)果 茜素紅染色結(jié)果顯示，與NC組相比，DEX組茜素紅染色變淺(圖1A)。對茜素紅染色進(jìn)行半定量檢測，結(jié)果顯示，與NC組相比，DEX組鈣結(jié)節(jié)含量顯著降低(P<0.01)。見圖1B。

2.2 miRNA的表達(dá) 熱圖分析結(jié)果顯示NC組和DEX組miRNA的表達(dá)模式存在差異(圖2A)?；鹕綀D顯示，與NC組相比，DEX組中有6個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，19個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)(圖2B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的miRNAs有25個(gè)，其中DEX組的6個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，19個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)，見表1。主成分分析結(jié)果顯示，基于miRNA差異表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結(jié)果的可靠性(圖2C)。此外，基因本體論(Gene Ontology，GO)分析結(jié)果顯示，上調(diào)的差異miRNAs的靶基因主要參與蛋白質(zhì)磷酸化、肌肉和器官發(fā)育、細(xì)胞黏附等生物過程(圖2D)，下調(diào)的差異miRNAs主要參與蛋白質(zhì)自磷酸化、蛋白質(zhì)泛素化、細(xì)胞內(nèi)雌激素受體信號通路、細(xì)胞增殖等生物過程(圖2E)。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析顯示，上調(diào)的差異miRNAs主要富集在脂肪合成相關(guān)信號通路、Ras信號通路、鈣信號通路等(圖2F)，下調(diào)的差異miRNAs主要富集在Wnt信號通路、Hippo信號通路等(圖2G)。

表1 DEX組與NC組差異表達(dá)的miRNAs

圖2 兩組miRNA的表達(dá)

2.3 piRNA的表達(dá) 熱圖分析結(jié)果顯示NC組和DEX組piRNA的表達(dá)模式存在差異(圖3A)?；鹕綀D顯示，與NC組相比，DEX組中有34個(gè)piRNAs表達(dá)上調(diào)，6個(gè)piRNAs表達(dá)下調(diào)(圖3B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的piRNAs有3個(gè)，其中DEX組的mmu_piR_025570表達(dá)上調(diào)，mmu_piR_026493、mmu_piR_026351表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)。主成分分析顯示，基于piRNA差異表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結(jié)果的可靠性(圖3C)。

圖3 兩組piRNA的表達(dá)

2.4 rasiRNA的表達(dá) 熱圖分析結(jié)果顯示NC組和DEX組rasiRNA的表達(dá)模式存在差異(圖4A)?；鹕綀D顯示，與NC組相比，DEX組中有3個(gè)rasiRNAs表達(dá)上調(diào)，2個(gè)rasiRNAs表達(dá)下調(diào)(圖4B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的rasiRNAs有2個(gè)(LTR、LTR/ERV1)，兩者在DEX組中的表達(dá)均上調(diào)(均P<0.05)。主成分分析顯示，基于rasiRNA差異表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結(jié)果的可靠性(圖4C)。

圖4 兩組rasiRNA的表達(dá)

2.5 snoRNA的表達(dá) 熱圖分析結(jié)果顯示NC組和DEX組snoRNA的表達(dá)模式存在差異(圖5A)?；鹕綀D顯示，與NC組相比，DEX組中有12個(gè)snoRNAs表達(dá)上調(diào)，11個(gè)snoRNAs表達(dá)下調(diào)(圖5B)。DEX組與NC組的差異基因中，|log2Fold Change|≥1的snoRNAs有8個(gè)，其中DEX組有6個(gè)snoRNAs表達(dá)上調(diào)，2個(gè)snoRNAs表達(dá)下調(diào)(均P<0.05)，見表2。主成分分析顯示，基于snoRNA差異表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結(jié)果的可靠性(圖5C)。

表2 DEX組與NC組差異表達(dá)的snoRNAs

圖5 兩組snoRNA的表達(dá)

2.6 snRNA的表達(dá) 火山圖分析表明，與NC組相比，DEX組中有3個(gè)snRNAs表達(dá)下調(diào)(圖6A)。差異基因中，|log2Fold Change|≥1的snRNA僅有ENSMUSG00000064856，該基因在DEX組中的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。主成分分析顯示，基于snRNA差異表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)降維，能夠很好地區(qū)分NC組和DEX組，保證分析結(jié)果的可靠性(圖6B)。

圖6 兩組snRNA的表達(dá)

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥的常見病因包括雌激素缺乏、某些藥物如糖皮質(zhì)激素的大量使用、吸煙以及遺傳因素等[18]。糖皮質(zhì)激素可以影響骨重建中的多種細(xì)胞類型，包括BMSCs、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等[6,19-21]。長期使用糖皮質(zhì)激素類藥物可促進(jìn)BMSCs的凋亡進(jìn)而導(dǎo)致骨形成減少[22]。由此可見，深入研究糖皮質(zhì)激素抑制BMSCs成骨分化潛在的分子機(jī)制，對于理解糖皮質(zhì)激素治療后發(fā)生骨質(zhì)疏松癥等疾病至關(guān)重要。

本研究結(jié)果顯示，與NC組相比，DEX組茜素紅染色變淺，鈣結(jié)節(jié)含量顯著降低(P<0.001)。王偉等[23]使用0.001 μmol/L至10 μmol/L濃度的地塞米松誘導(dǎo)脂肪來源的干細(xì)胞成骨分化，結(jié)果顯示0.01μmol/L濃度的地塞米松誘導(dǎo)成骨后其礦化程度達(dá)到最高峰，而隨著地塞米松濃度的升高，干細(xì)胞成骨分化能力被顯著抑制。由此可見，高濃度地塞米松顯著抑制BMSCs的成骨分化能力。

本研究的測序結(jié)果主要包括miRNA、piRNA、rasiRNA、snoRNA和snRNA五大類，其中miRNA、piRNA、snoRNA為有較多顯著性差異表達(dá)的基因。本研究結(jié)果顯示，DEX組miR-490-3p、miR-451a、miR-675-3p、miR-150-5p的表達(dá)顯著下調(diào)(均P<0.05)。既往研究結(jié)果顯示，在胸椎黃韌帶骨化疾病中，過表達(dá)miR-490-3p可直接靶向FOXO1并抑制其表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控胸椎黃韌帶細(xì)胞的成骨分化[24]。此外，miR-451a、miR-675-3p等靶向骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路調(diào)控骨形成[25]。Wang等[26]的研究表明miR-150-5p與BMSCs成骨分化正相關(guān)。然而，上述基因在地塞米松抑制成骨分化中的作用尚未完全明確。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了mmu-novel-1、mmu-novel-121等尚未被數(shù)據(jù)庫收錄的miRNAs，這些miRNAs具體的生物學(xué)功能有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

GO分析和KEGG分析表明，高濃度地塞米松上調(diào)的miRNAs主要富集的信號通路與脂肪合成相關(guān)，而下調(diào)的miRNAs主要富集于Wnt信號通路、Hippo信號通路，這些信號通路與成骨相關(guān)[27-28]。He等[29]報(bào)道在地塞米松誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥模型中，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ表達(dá)增強(qiáng)，并通過靶向Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)BMSCs成骨分化。此外，地塞米松處理后的干細(xì)胞外泌體中miR-365a-5p可有效激活Hippo信號通路進(jìn)而促進(jìn)成骨分化[30]。因此，這提示了高濃度地塞米松可能靶向調(diào)控多個(gè)miRNAs及通路，通過促進(jìn)BMSCs成脂肪分化能力以及抑制成骨分化能力等加重骨骼穩(wěn)態(tài)失衡。

本研究發(fā)現(xiàn)了34個(gè)piRNAs表達(dá)呈顯著性上調(diào)，而有6個(gè)piRNAs表達(dá)顯著性下調(diào)；3個(gè)rasiRNAs表達(dá)顯著性上調(diào)，而有2個(gè)rasiRNAs表達(dá)顯著性下調(diào)；12個(gè)snoRNAs表達(dá)顯著性上調(diào)，11個(gè)snoRNAs表達(dá)顯著性下調(diào)；3個(gè)snRNAs表達(dá)顯著性下調(diào)。本研究中，DEX組的LTR顯著上調(diào)了4.5倍左右(P<0.05)，既往研究報(bào)道LTR是骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的下游靶基因，但其對于成骨分化的作用尚未明確[31]。其他的piRNA、rasiRNA、snoRNA和snRNA目前尚無可用的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能預(yù)測，未來需要進(jìn)行更多的研究探索這些sncRNAs在糖皮質(zhì)激素抑制BMSCs成骨分化過程中的作用。

本研究通過使用高通量small RNA測序技術(shù)檢測地塞米松抑制BMSCs成骨分化過程中sncRNA的表達(dá)情況，這些sncRNA受到地塞米松調(diào)控并且可能通過下游靶基因間接調(diào)控BMSCs的成骨分化潛能，這也提示了表觀遺傳修飾在其中的廣泛參與。本課題組將在后續(xù)研究中篩選出預(yù)測miRNA的靶基因，此外在細(xì)胞和動物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)的miRNA在激素性骨質(zhì)疏松癥中的生物學(xué)功能。目前除miRNA以外的sncRNA尚缺乏成熟的生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，且其相關(guān)的數(shù)據(jù)庫尚未完善，因此我們將繼續(xù)深入研究這些sncRNAs及其靶基因，為未來糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的理論基礎(chǔ)。