不同土壤種植的靈芝超微粉增強(qiáng)小鼠免疫功能的比較研究

于曉風(fēng)，付雯雯，徐華麗，丁春予，睢大筼

（吉林大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室·吉林 長(zhǎng)春·130021）

赤芝（G.lucidum·karst）為擔(dān)子菌類(lèi)多孔菌科靈芝屬，靈芝或紫芝的子實(shí)體，作為藥物已正式被國(guó)家藥典收載。目前已從靈芝子實(shí)體分離得到百余種化學(xué)成分，包括多糖類(lèi)、三萜及甾醇類(lèi)、氨基酸類(lèi)、多肽類(lèi)、蛋白類(lèi)、核苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)以及多種微量元素等[1-3]。靈芝具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老及保肝等功效[4、5]。由于靈芝在一塊土地栽培存在易染菌、不能連種等問(wèn)題，目前多采用種植一年更換新地，或在原有土地加一層山沙土，過(guò)度采挖山沙土嚴(yán)重破壞了自然環(huán)境。

本課題組在吉林省蛟河市黃松甸鎮(zhèn)南頂子建立了一棟標(biāo)準(zhǔn)靈芝栽培大棚，分別以山核桃殼、玉米芯和玉米秸稈20目粗粉作為土壤栽培靈芝，旨在解決土地資源問(wèn)題，也減少山核桃殼、玉米棒及玉米秸稈的廢棄污染。本文將從細(xì)胞免疫功能測(cè)定、體液免疫功能測(cè)定、單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定以及NK細(xì)胞活性測(cè)定4個(gè)方面對(duì)比觀察山核桃殼、山沙土、玉米芯及玉米秸稈作為栽培土壤培育的靈芝超微粉對(duì)小鼠非特異性及特異性免疫功能的影響，為確證以山核桃殼、玉米棒及玉米秸稈代替山沙土栽培靈芝的可行性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)ICR雄性小白鼠，體重18.0～20.0g，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（吉）2007-0003。實(shí)驗(yàn)在溫度為24℃、濕度為60%的安靜環(huán)境下進(jìn)行。

1.2 藥材

山核桃殼、山沙土、玉米芯及玉米秸稈作為栽培土壤培育的靈芝，分別為靈芝1號(hào)、靈芝2號(hào)、靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)，均由吉林昆閬醫(yī)藥有限公司提供，粉碎成400目的超微粉，批號(hào)：20200508。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能的影響

90只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組，每組10只。對(duì)照組每日灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉20ml/kg，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組均分別灌胃給予靈芝超微粉0.5、1.0g/kg，每日1次，連續(xù)灌胃30天。末次藥后1小時(shí)，每只小鼠尾靜脈注射印度墨汁（以生理鹽水稀釋10倍）10ml/kg，分別于注射后1min及5min從小鼠內(nèi)眥靜脈采血20μl，溶于0.1%碳酸氫鈉溶液中，以722分光光度計(jì)680nm處測(cè)量OD值。于第二次采血后脫臼處死小鼠，取胸腺、脾臟和肝臟準(zhǔn)確稱(chēng)重，以胸腺、肝臟和脾臟重量(mg)/體重(10g)計(jì)算胸腺、肝臟和脾臟系數(shù)，按下列公式計(jì)算吞噬指數(shù)（k）和吞噬活性（a）。

1.3.2 對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠血清溶血素生成的影響

90只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組，每組10只。對(duì)照組每日灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉20ml/kg，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組均分別灌胃給予靈芝超微粉0.5、1.0g/kg，每日1次，連續(xù)灌胃30天。給藥第26天，每只小鼠腹腔注射5%（v/v）生理鹽水雞紅細(xì)胞懸液0.2ml進(jìn)行免疫。末次藥后1小時(shí)，眼球取血，離心，取血清。用生理鹽水稀釋100倍，取稀釋后血清0.5ml與5%（v/v）雞紅細(xì)胞懸液0.25ml，10%（v/v）補(bǔ)體0.25ml混勻，37°C恒溫箱孵育30min，置2～4°C冰箱30min終止反應(yīng)，1500r/min離心5min，取上清液200μl加入96孔版，每只小鼠設(shè)3副孔，在酶標(biāo)儀540nm下讀數(shù)，以O(shè)D值作為血清血溶素指標(biāo)。另設(shè)不加血清空白孔作對(duì)照孔。

1.3.3 對(duì)小鼠T細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的影響

90只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組，每組10只。對(duì)照組每日灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉20ml/kg，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組均分別灌胃給予靈芝超微粉0.5、1.0g/kg，每日1次，連續(xù)灌胃30天。末次藥后1小時(shí)，無(wú)菌取脾，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞濃度為1×107/ml脾細(xì)胞懸液。在96孔培養(yǎng)板中每孔加入100μl細(xì)胞懸液。每只小鼠設(shè)3副孔，加100μl 1640培養(yǎng)液。另設(shè)ConA刺激3副孔，每孔加入100μl脾細(xì)胞懸液及100μlConA。置于37°，5%CO2培養(yǎng)箱孵育44h后每孔加入MTT 10μl，繼續(xù)置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。棄上清，每孔加入DMSO 100μl，微型震蕩器震蕩至結(jié)晶完全溶解。酶標(biāo)儀570nm測(cè)量，按下列公式計(jì)算刺激指數(shù)（SI）。

1.3.4 對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

90只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組，每組10只。對(duì)照組每日灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉20ml/kg，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組均分別灌胃給予靈芝超微粉0.5、1.0g/kg，每日1次，連續(xù)灌胃30天。末次藥后1小時(shí)，無(wú)菌取脾，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞濃度為1×106/ml脾細(xì)胞懸液。靶細(xì)胞取培養(yǎng)24～48h的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml。U型96孔板加入脾細(xì)胞懸液100μl，每只小鼠設(shè)3副孔，加入靶細(xì)胞懸液100μl。另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔3副孔，加入脾細(xì)胞懸液100μl及1640完全培養(yǎng)液100μl。設(shè)靶細(xì)胞對(duì)照孔3副孔，加100μl靶細(xì)胞懸液及1640完全培養(yǎng)液。每孔加入MTT 10μl（5mg/ml），置于37°5%CO2孵育箱中共同孵育4h，離心，棄上清。每孔加入DMSO 100μl，微型振蕩器震蕩至結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀570nm下讀數(shù)。按下列方法計(jì)算NK細(xì)胞活性，以殺傷率（%）表示。

殺傷率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值）/靶細(xì)胞OD值]×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠臟器系數(shù)及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬能力的影響

與對(duì)照組比較，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)低、高劑量組均能明顯提高小鼠胸腺和脾臟系數(shù)，增強(qiáng)吞噬指數(shù)K和吞噬活性α（P＜0.05或P＜0.01），各組之間均無(wú)明顯差異（P＞0.05），詳見(jiàn)表1、2。

表1 不同土壤種植的靈芝超微粉對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n=10）

表1 不同土壤種植的靈芝超微粉對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響（±s，n=10）

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量（g/kg）胸腺系數(shù) 肝臟系數(shù) 脾臟系數(shù)對(duì)照組 — 12.21±3.05 526.1±53.2 34.53±5.12靈芝1號(hào)0.5 14.65±2.96* 528.3±59.5 47.96±5.13*1.0 16.28±2.24** 541.5±64.7 49.28±7.14*靈芝2號(hào)0.5 14.74±3.05* 535.9±62.3 48.21±5.95*1.0 16.14±5.75* 557.5±71.2 58.12±3.36**靈芝3號(hào)0.5 14.59±2.67* 516.8±58.2 47.85±4.81*1.0 16.35±3.18** 529.1±78.6 48.76±5.23*靈芝4號(hào)0.5 15.05±4.56* 536.4±61.7 49.05±5.37*1.0 17.12±5.07** 562.1±84.3 62.47±8.26**

表2 不同土壤種植的靈芝超微粉對(duì)小鼠碳廓清能力的影響（±s，n=10）

表2 不同土壤種植的靈芝超微粉對(duì)小鼠碳廓清能力的影響（±s，n=10）

與對(duì)照組比較**P＜0.01

組別 劑量（g/kg） 吞噬指數(shù)K 吞噬活性α對(duì)照組 — 0.058±0.012 6.35±0.37靈芝1號(hào) 0.5 0.077±0.024* 7.36±0.35*1.0 0.091±0.023** 7.96±0.34**靈芝2號(hào) 0.5 0.075±0.018* 7.35±0.21*1.0 0.080±0.037* 7.38±0.38*靈芝3號(hào) 0.5 0.078±0.036* 7.40±0.43*1.0 0.083±0.029* 7.57±0.48*靈芝4號(hào) 0.5 0.080±0.025* 7.42±0.45*1.0 0.093±0.026** 8.04±0.51**

2.2 對(duì)小鼠血清溶血素、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞活性的影響

與對(duì)照組比較，靈芝1號(hào)，靈芝2號(hào)，靈芝3號(hào)及靈芝4號(hào)組均能明顯提高小鼠血清溶血素生成OD值，T淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)及NK細(xì)胞殺傷率（P＜0.05或P＜0.01），各組之間均無(wú)明顯差異（P＞0.05），詳見(jiàn)表3。

表3 不同土壤種植的靈芝超微粉對(duì)小鼠溶血素、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞活性的影響（±s，n=10）

表3 不同土壤種植的靈芝超微粉對(duì)小鼠溶血素、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及NK細(xì)胞活性的影響（±s，n=10）

與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量（g/kg）溶血素生成值 刺激指數(shù) 殺傷率（%）對(duì)照組 — 0.15±0.03 0.26±0.14 0.22±0.08靈芝1號(hào)0.5 0.17±0.04 0.34±0.16 0.27±0.10 1.0 0.20±0.03* 0.54±0.17* 0.50±0.13*靈芝2號(hào)0.5 0.19±0.04* 0.51±0.12* 0.48±0.11*1.0 0.21±0.05* 0.53±0.18* 0.51±0.15*靈芝3號(hào) 0.5 0.20±0.04* 0.52±0.16* 0.52±0.17*1.0 0.22±0.08* 0.59±0.13** 0.62±0.16**靈芝4號(hào)0.5 0.21±0.05* 0.55±0.21* 0.50±0.13*1.0 0.25±0.06** 0.63±0.15** 0.64±0.12**

3 討論

人體免疫器官主要包括骨髓、胸腺、淋巴結(jié)、脾和淋巴器官。胸腺為T(mén)細(xì)胞的分化提供了微環(huán)境，T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育至成熟后轉(zhuǎn)移到外周血液。脾為人體最大的外周免疫器官，破壞衰老紅細(xì)胞。來(lái)自血液的抗原被單核巨噬細(xì)胞清除，或降解成為抗原分子激活T細(xì)胞和B細(xì)胞從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的發(fā)生。故胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)可反映機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)[6]。小鼠受雞紅細(xì)胞免疫后產(chǎn)生抗雞紅細(xì)胞抗體，體外與雞紅細(xì)胞混合致敏，在補(bǔ)體參與下可使雞紅細(xì)胞溶解，釋出血紅蛋白，使溶液呈紅色。測(cè)定其上清液之吸光度可間接判斷血清中抗體形成的數(shù)量[7]。異源動(dòng)物紅細(xì)胞免疫動(dòng)物后，B淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生抗RBC抗體，即溶血素，體外與免疫源性RBC溫育后，在補(bǔ)體參與下可產(chǎn)生溶血反應(yīng)，檢測(cè)反應(yīng)體系光密度值可以反映溶血素水平，以評(píng)價(jià)機(jī)體的體液免疫機(jī)能[8]。外周T細(xì)胞分為CD4+T和CD8+T兩個(gè)細(xì)胞亞群。CD4+T一般通過(guò)合成和分泌細(xì)胞因子發(fā)揮輔助和效應(yīng)功能，部分CD4+T細(xì)胞克隆在分泌IL-2的同時(shí)具有包括清除自身分泌抗體的B細(xì)胞在內(nèi)的靶細(xì)胞殺傷能力，CD8+T細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)使細(xì)胞裂解或者誘導(dǎo)靶細(xì)胞程序死亡。T細(xì)胞在體外可被刀豆蛋白A誘導(dǎo)增值[9]。自然殺傷（NK）細(xì)胞是一類(lèi)獨(dú)特的淋巴細(xì)胞亞群，根據(jù)CD56分子的表面密度，將NK細(xì)胞分為CD56 bright和CD56 dim兩個(gè)亞群，前者以分泌細(xì)胞因子為主，后者以殺傷功能為主[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山核桃殼、山沙土，玉米芯及玉米秸稈土壤培育的靈芝超微粉均能明顯提高小鼠胸腺和脾臟系數(shù)，增強(qiáng)碳粒廓清吞噬指數(shù)和吞噬活性，具有誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增值作用，可促進(jìn)NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷能力，提高雞紅細(xì)胞作為抗原誘導(dǎo)的小鼠抗體生成能力，提示其對(duì)機(jī)體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能及體液免疫和細(xì)胞免疫具有增強(qiáng)作用。等劑量下，山核桃殼、山沙土，玉米芯及玉米秸稈土壤培育的靈芝超微粉對(duì)小鼠非特異性及特異性免疫功能的增強(qiáng)作用無(wú)明顯差異。