先天性腎上腺發(fā)育不良癥基因-1對(duì)垂體瘤細(xì)胞自噬和增殖的調(diào)控作用

陳賢斌，胡瓊霜，呂芳芳，盧江龍，李群

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科，浙江 溫州 325027

垂體腺瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的腫瘤[1]，主要包括泌乳素腺瘤、生長(zhǎng)激素細(xì)胞腺瘤和無(wú)功能腺瘤等[2]，其中泌乳素腺瘤是最常見(jiàn)的亞型[3]。目前泌乳素腺瘤首選藥物治療，常用治療藥物有溴隱亭（bromocriptine, BRC）和卡麥角林（cabergoline, CAB），這兩種藥物能夠使80%～90%的患者獲益[4]。但仍有10%～20%的患者對(duì)藥物治療不敏感、甚至無(wú)效，此類(lèi)患者往往手術(shù)治療后仍然難以恢復(fù)正常的泌乳素水平[5]。因此探尋泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和解決垂體瘤耐藥問(wèn)題至關(guān)重要。先天性腎上腺發(fā)育不良癥基因-1（dosage-sensitivesexreversaladrenalhypoplasiacongenitaregionontheXchromosome1, DAX-1）基因?qū)儆诤耸荏w（nuclearreceptors, NRs）家族。最近發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[6]，如乳腺癌[7]、宮頸癌[8]等，但未見(jiàn)其與垂體瘤增殖和自噬的相關(guān)研究。本研究主要討論DAX-1 對(duì)垂體泌乳素腺瘤的增殖和藥物敏感性的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠垂體瘤（MMQ）細(xì)胞系細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于北京中原聚合生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所需的胎牛血清、馬血清，以及F12K細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗購(gòu)于美國(guó)Life公司；TRIzol和RNA抽提試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，SYBRGreen、realtimePCRMasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒和BCA試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京碧云天生物有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timequantitativepolymerasechainreaction, RT-qPCR）所需引物由上海生工生物工程有限公司代為設(shè)計(jì)合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：MMQ細(xì)胞培養(yǎng)于Ham’sF-12K（Kaighn’s）培養(yǎng)基中添加12.5%的馬血清、2.5%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素，MMQ細(xì)胞培養(yǎng)傳代于上述培養(yǎng)基，并在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染：將MMQ細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板，每孔約3×105個(gè)細(xì)胞，24h后用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA（由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成，序列5’-GCACGUGGCUCCUUAGCGAU-3’）轉(zhuǎn)染至MMQ細(xì)胞敲低DAX-1的表達(dá)（DAX-1KD組）；DAX-1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（上海吉瑪公司合成）轉(zhuǎn)染至MMQ細(xì)胞提高DAX-1的表達(dá)（DAX-1OE組），6h換液，48h后收獲細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)；并設(shè)正常對(duì)照組（NC組）。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將預(yù)處理后的MMQ細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（5×103個(gè)細(xì)胞/孔），分別培養(yǎng)24、48、72、96h后，根據(jù)CCK-8使用說(shuō)明，每個(gè)孔加入10μLCCK-8溶液后，37℃孵育1～2h，用酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸光度，并依據(jù)（A450樣品-A450背景/A450對(duì)照-A450背景）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活性，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔；其中為了探究DAX-1對(duì)CAB和BRC的藥物治療有無(wú)促進(jìn)作用，用CAB和BRC與DAX-1過(guò)表達(dá)共同作用于MMQ細(xì)胞?？寺?shí)驗(yàn)：預(yù)處理的MMQ細(xì)胞（1×103細(xì)胞/孔）被接種到6孔板上培養(yǎng)14d，在肉眼可見(jiàn)克隆形成后去除培養(yǎng)基，并用4%多聚甲醛室溫固定15min，然后用1%結(jié)晶紫染色液染色10min，0.9%NaCl溶液反復(fù)沖洗干凈、拍照。

1.2.3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)：使用TRIzol試劑分別提取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的MMQ細(xì)胞中的總RNA，然后進(jìn)行濃度測(cè)定和純度判斷，按照分光光度計(jì)讀數(shù)2.0＞A260/A280＞1.8判斷純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模版，每個(gè)樣本RNA總量為1000ng，然后按照SYBRGreen、RealtimePCRMasterMix試劑盒的操作要求行RT-qPCR，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。獲取數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的自噬相關(guān)基因表達(dá)倍數(shù)的變化，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）檢測(cè)：細(xì)胞和組織樣本用無(wú)菌管收集，并用冷PBS洗滌兩次去除雜質(zhì)，然后利用超聲破碎儀破碎細(xì)胞和組織，加入適量的RIPA細(xì)胞蛋白裂解液裂解樣本獲取總蛋白；然后用BCA方法標(biāo)定蛋白濃度，每個(gè)樣本上樣40μg蛋白總量，SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜蛋白樣本并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1～2h后用相應(yīng)的蛋白一抗在4℃孵育過(guò)夜。然后在室溫下，將膜與HRP標(biāo)記的二抗孵育1h，TBST洗膜3次后顯影，具體抗體見(jiàn)表2。

表1 RT-qPCR所用引物序列

表2 Westernblot實(shí)驗(yàn)所用抗體信息

1.2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)：預(yù)處理的細(xì)胞爬片用PBS緩沖液輕輕洗3次，每次5min，用4%多聚甲醛浸沒(méi)爬片，室溫固定15min。然后用0.1%的TrionX-100破膜15min，PBS緩沖液洗3次。接下來(lái)用3%的BSA室溫封閉30min后，加入LC3抗體（稀釋比例1:100），浸沒(méi)爬片，然后4℃冰箱平放過(guò)夜。過(guò)夜后獲取爬片，PBS緩沖液洗3次后加入熒光二抗（invitrogen，A-11008），室溫下避光孵育1h，PBS洗3次后用抗熒光淬滅劑封片處理后于倒置熒光顯微鏡下拍片。

1.2.6 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0007）]，5周齡的雌性BALB/c無(wú)胸腺裸鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，將不帶有血清的NC組MMQ細(xì)胞株和DAX-1KD組MMQ細(xì)胞株（5×106）用基質(zhì)凝膠和PBS緩沖液（美國(guó)BD生物公司，#356234）混勻后，皮下注射到每只裸鼠的左背部。當(dāng)肉眼可見(jiàn)皮下腫瘤生成時(shí)，每4d用游標(biāo)卡尺記錄下腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），a×b2/2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。24h后麻醉處死小鼠，獲取腫瘤，拍照并提取腫瘤蛋白標(biāo)本。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組基因芯片及分析方法：本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2016-082）。將垂體瘤和正常垂體標(biāo)本利用TRIzol提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后移交上?；菅猩锟萍加邢薰?，采用IlluminaHiseq2000測(cè)序平臺(tái)的單端50bp測(cè)序模式對(duì)核酸樣本進(jìn)行高通量測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)引物與adaptor序列去除并經(jīng)過(guò)對(duì)測(cè)序片段3’端的質(zhì)量檢驗(yàn)，并選擇質(zhì)量可靠的測(cè)序片段而將低質(zhì)量堿基動(dòng)態(tài)從3’末端刪除以最終保留高測(cè)序質(zhì)量的堿基片斷。保留的測(cè)序序列（remainedreads）片斷用于后續(xù)RNA-Seq項(xiàng)目分析模塊的分析。然后將獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化分析，以差異倍數(shù)（Log2FC）＞2，P＜0.05為準(zhǔn)，進(jìn)行篩選繪制熱圖和火山圖；本研究另一項(xiàng)侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體瘤差異表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于GEODataSets數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GSE51618），利用內(nèi)置GEO2R軟件分析獲得DAX-1差異表達(dá)數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphpadPrism8.0軟件和SPSS20.0軟件進(jìn)行作圖和數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用±s 表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAX-1在垂體瘤和侵襲性垂體瘤中的表達(dá)水平 利用高通量測(cè)序技術(shù)，篩選4例正常垂體和12例垂體瘤標(biāo)本中的轉(zhuǎn)錄組水平差異，按照差異倍數(shù)2倍以上、P＜0.05 的要求篩選差異基因，見(jiàn)圖1A；分析火山圖發(fā)現(xiàn)DAX-1 在垂體瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1B和圖1C；與非侵襲性垂體瘤比，用GEO基因數(shù)據(jù)集篩選出GSE51618數(shù)據(jù)集中侵襲性垂體瘤中DAX-1的表達(dá)水平也降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1D。

2.2 DAX-1對(duì)MMQ細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的調(diào)控 與NC組比，DAX-1OE組細(xì)胞活性在72h和96h明顯低于NC組，而DAX-1KD組細(xì)胞活性明顯高于NC組（P＜0.05），見(jiàn)圖2A；平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示，與NC比，DAX-1OE組克隆形成數(shù)目減少，而DAX-1KD組與NC組比較細(xì)胞克隆形成數(shù)目增加，見(jiàn)圖2B。與NC組比，DAX-1OE組CAB和BRC對(duì)MMQ細(xì)胞活性的抑制能力更強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2C和2D，提示DAX-1可能能夠促進(jìn)CAB和BRC對(duì)MMQ細(xì)胞的藥物殺傷作用。

圖1 DAX-1 基因在垂體瘤中表達(dá)情況比較

圖2 DAX-1 對(duì)MMQ細(xì)胞增殖的調(diào)控

2.3 敲低DAX-1 對(duì)MMQ細(xì)胞內(nèi)自噬的影響 檢測(cè)MMQ細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，與NC組比，DAX-1KD組中自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7和ATG12的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3A；Westernblot實(shí)驗(yàn)顯示與NC組比，DAX-1KD組細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記蛋白LC3-II和P62的表達(dá)也降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3B；免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明LC3蛋白在DAX-1 敲低后顯著下降，見(jiàn)圖3C。

2.4 敲低DAX-1對(duì)MMQ細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和自噬的影響 每4d一次記錄腫瘤生長(zhǎng)曲線，MMQ細(xì)胞裸鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DAX-1KD組MMQ細(xì)胞移植瘤

3 討論

垂體腺瘤尤其是垂體泌乳素腺瘤屬于臨床常見(jiàn)內(nèi)分泌腫瘤，以中青年女性患者多見(jiàn)，成人患者男女比例約1:10，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)每年新增泌乳素腺瘤患者人數(shù)約有10萬(wàn)人[3]，其臨床癥狀重、治療難度大、復(fù)發(fā)率高[9]，主要臨床表現(xiàn)為由高泌乳素血癥引起的異常乳汁分泌、性功能減退、不孕不育、體質(zhì)量增加等，同時(shí)由于巨大腫瘤的壓迫效應(yīng)，引起局部顱內(nèi)壓力增高而導(dǎo)致頭痛、視力下降甚至失明等，藥物甚至手術(shù)均無(wú)法完全解決泌乳素腺瘤引起的各種臨床癥狀[10]。以往的研究表明，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體異常表達(dá)和PRDM2、PRB3等表達(dá)減少是垂體瘤發(fā)生發(fā)展或耐藥的重要原因，但許多關(guān)鍵機(jī)制目前仍然不清楚。本研究通過(guò)探索DAX-1 基因與泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展和藥物治療敏感性的相關(guān)性，旨在發(fā)現(xiàn)泌乳素腺瘤臨床治療的新靶標(biāo)。

DAX-1 家族是一類(lèi)配體激活轉(zhuǎn)錄因子家族，在個(gè)體的發(fā)育、代謝、分化以及其他各種疾病的發(fā)生發(fā)展中充當(dāng)重要的角色[11]。1994年最初發(fā)現(xiàn)DAX-1位于X染色體的短臂（Xp21）上，其與腎上腺發(fā)育不良相關(guān)[12]。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，DAX-1 等異常表達(dá)或突變往往與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)：例如DAX-1 的過(guò)度表達(dá)往往能夠與SF-1 協(xié)同發(fā)揮作用從而引起小兒腎上腺皮質(zhì)癌的發(fā)生[13]；與正常的肝細(xì)胞組織比，在肝細(xì)胞癌中DAX-1 的表達(dá)下降，而分子機(jī)制研究表明DAX-1能夠結(jié)合β-catenin蛋白，從而抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力[14]；在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)雄激素能夠誘導(dǎo)DAX-1的表達(dá)上升，而DAX-1能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制作用抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞株中芳香酶的產(chǎn)生，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。但目前為止鮮見(jiàn)DAX-1調(diào)控垂體瘤發(fā)生發(fā)展或藥物治療的相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)DAX-1在垂體瘤中表達(dá)降低，并且過(guò)表達(dá)DAX-1能夠抑制大鼠泌乳素瘤MMQ細(xì)胞增殖，而敲低DAX-1能夠促進(jìn)MMQ細(xì)胞的體內(nèi)外增殖速度，因此DAX-1可能是和垂體泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因。

自噬是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的降解-再循環(huán)系統(tǒng)，自噬對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞器更新、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持起到重要的作用[16]，自噬在泌乳素腺瘤的藥物治療機(jī)制中發(fā)揮極其重要的作用。多巴胺5型受體（dopaminetype5receptor, DRD5）激動(dòng)劑SKF83959能夠通過(guò)誘導(dǎo)ROS的積聚促進(jìn)自噬的發(fā)生，引起MMQ細(xì)胞的自噬性死亡，并且DRD5激動(dòng)劑能夠有效抑制AKT/mTOR信號(hào)通路，該通路是自噬發(fā)生的重要通路[17]；研究還發(fā)現(xiàn)臨床一線抗瘧藥物氯喹能夠有效增加CAB對(duì)MMQ細(xì)胞的殺傷作用，敲除自噬相關(guān)基因ATG7能顯著逆轉(zhuǎn)CAB誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[18]。長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19和miR-93a能夠通過(guò)調(diào)控ATG7 基因調(diào)控泌乳素瘤細(xì)胞的增殖速度和藥物敏感性[19-21]。而本研究發(fā)現(xiàn)敲低DAX-1能夠促進(jìn)MMQ細(xì)胞的生長(zhǎng)并且抑制自噬，而過(guò)表達(dá)DAX-1 又能夠促進(jìn)CAB和BRC的藥物作用強(qiáng)度，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示敲低DAX-1能夠抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此，DAX-1 介導(dǎo)的自噬可能和垂體泌乳素腺瘤的增殖以及藥物治療敏感性具有一定的相關(guān)性。但本研究未深入探索DAX-1 調(diào)整細(xì)胞內(nèi)自噬水平的具體分子機(jī)制，有待后續(xù)研究。

圖4 敲低DAX-1 對(duì)垂體瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和自噬的影響